Fusobacterium nucleatum laktat dehidrogenez enzimini kodlayan genın izolasyonu klonlanması ve analizi

Abstract

Birçok iltihaplı hastalıklara sebep olan Fusobacterium nucleatum fusobakteri ailesinden, gram negatif ve obligatif anaerob bakteridir. İnvaziv ve pro-inflamatuar etkiye sahip bu anaerobik bakteri kolorektal karsionama, periodontal hastalıklar ve perikardit gibi birçok yumuşak doku hastalığına sebep olmaktadır. Dünya sağlık örgütünün raporlarında göre, Fusobacterium nucleatum kaynaklı kolorektal kanser vakalarında 610.000’e yakın ölüme neden olmaktadır. Bu sebeple bakteriyel infeksiyonu baskılamak amacıyla F. nucleatum’un metabolizmasının bilinmesi gerekmektedir. Laktat dehidrogenaz enzimi anaerobik glikolizis ve hücre içi biyomoleküllerin üretiminde önemli rol oynamaktadır. Bu enzim yeni ilaç tasarım çalışmalarında muhtemel hedef molekül seçilmiştir. Bu tez çalışmasında laktat dehidrogenaz enzimini kodlayan gen Fusobacterium nucleatum genomik DNA’sından izole edilmiş, PCR ile amplifiye edilmiştir ve literatürde ilk defa standart protokol uygulanarak pGEM-T easy vector sistemine klonlanmıştır. Klonlanan Fusobacterium nucleatum laktat dehidrogenaz (FnLDH) enzimini kodlayan gen nükleotit ve aminoasit düzeyinde analiz edilmiştir. FnLDH aminoasit dizisinin insandaki eşdeğeri olan LDH ile çakıştırılması ile 98-109 residüleri arasındaki enzimin aktif bölgesi önemli farklılıklar göstermiştir. Gen ifadesi için FnLDH geni ekspresyon vektörü olan pKK223-3 vektörüne alt-klonlama yapılmış ve E. coli JM109 hücresinde ifadesi yapılmıştır. Hücrelerin sonikasyonu sonrası supernatant kısmında az miktarda protein gözlemlenmiş ve enzimin çoğu pellet xiii

kısmında bulunmuştur. Uygun sistemlerde gen ifadesi sonrası aktif ve çözünebilir fazda protein üretimi, yapıya dayandırılmış ilaç tasarım çalışmalarında oldukça önemlidir. Yapılan SDS-PAGE analizi sonucu 34.697 Da moleküler ağırlıktaki protein gözlemlenmiştir fakat yeterli miktarda üretim ve aktif enzim olmadığından, aLICator LIC ekspresyon sisteminin avantajlarından yararlanmak amacıyla FnLDH geni pLATE31 vektörüne klonlanmıştır. Çözünebilir fraksiyonda başarılı bir şekilde ifade edilmiş ve Ni-NTA agaroz kolonu kullanılarak % 95 oranında saflaştırılabilmiştir. Saflaştırılan 34.697 Da molekül ağırlığındaki FnLDH SDS-PAGE’de analiz edilmiştir. Saflaştırılan FnLDH enziminin spesifik aktivitesi, NADH ve piruvat kullanılarak ölçülmüştür ve daha sonraki kinetik analizler için yeterli aktivite görülmüştür. Çalışmamızda üç boyutlu kristal yapısı bilinen Lactobacillus casei L-laktat dehidrogenaz kalıp alınarak Fusobacterium nucleatum laktat dehidrogenaz enzimi için bir model oluşturulmuştur. Bu iki enzim arasındaki benzerlik %41’dir. Proteinlerin üç boyutlu yapısını modellemek için karşılaştırmalı modelleme prensibine dayanan homoloji modelleme yöntemi kullanılmıştır. Oluşturulan 3D yapısı MODELLER programı kullanılarak yapılandırılmıştır. Bu program yapısı belirlenmek istenen yapı ile bilinen yapıları karşılaştırarak model oluşturur. 3D boyutlu yapı ile ilgili değerlendirmeler ve düzeltmeler web tabanlı ERRAT, PROSA, HYPERCHEM ve RAMPAGE kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Proteindeki muhtemel ligand bağlanma bölgeleri web tabanlı SiteFinder, Pocket-Finder ve DoGSiteScorer programları kullanılarak belirlenmiştir. 98-109 arası residüler ligandın bağlanması için en uygun bölge olduğu ve bu bölgenin insan kas LDH’ında eşdeğer bölgesinden farklılık gösterdiği tespit edilmiştir. Mevcut çalışma Fusobacterium nucleatum’un enerji metabolizmasında laktat dehidrogenaz enziminin rolünün ve yapıya dayandırılmış ilaç tasarım çalışmalarında kullanılabilir uygulamaların anlaşılmasına yardımcı olabileceği düşünülmektedir.