Kıkırdak doku mühendisliğinde kullanılmak üzere mezenkimal kök hücreler ile poli (ɛ-kaprolakton) scaffold arasındaki etkileşimin incelenmesi ve 3d doku modelinin geliştirilmesi

Abstract

İnsanlarda kıkırdak hasarı, Dünyada ve Türkiye'de görülme sıklığı gün geçtikçe artan sağlık problemlerinden biridir. Sağlık Bakanlığı tarafından 2010 yılında 15 yaş üstü bireylerde yapılan bir araştırmaya göre; ülkemizde 4,7 milyon kişinin kıkırdak dejenerasyonu hastası olduğu rapor edilmiştir. Kıkırdak tedavisinde çeşitli yöntemler (konservatif ve cerrahi) uygulanmasına rağmen, problemlerin giderilmesinde halen ciddi sorunlar mevcuttur. Bu nedenle son yıllarda kıkırdak doku mühendisliğine yönelik çalışmalar oldukça önem kazanmıştır. Özellikle doku mühendisliğinde kök hücre (KH) ve biyomalzeme alanındaki gelişmeler kıkırdak hasarlarının giderilmesinde yeni umutlara yol açmıştır. Biyomalzemeler arasında kıkırdak doku mühendisliğinde en çok kullanılan scaffoldlardan (doku iskelesi) bir tanesi poli epsilon kaprolakton (PCL)'dur. Son yıllarda PCL ve mezenkimal kök hücreler (MKH) arasında yapılan çeşitli çalışmalar bulunmasına rağmen, şimdiye kadar PCL'nin hangi doku kaynağından elde edilen mezenkimal kök hücreler ile daha iyi etkileşime girdiğini gösteren çalışmalar oldukça yetersizdir. Bununla birlikte PCL scaffold ile mezenkimal kök hücrelerden oluşan üç boyutlu kültürlerin kondrosit farklılaşması üzerindeki etkisi ile ilgili çalışmalar da az sayıdadır. Ayrıca, kıkırdak doku mühendisliğinde kullanılmak amacıyla; PCL scaffold ile olfaktör bulb kaynaklı mezenkimal kök hücreler arasındaki etkileşimle ilgili literatürde herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır. Buna göre de bu tez çalışmasının amacı; adipoz, kordon matrisi ve olfaktör bulb gibi farklı kaynaklardan elde edilen mezenkimal kök hücreler ile PCL scaffold arasındaki etkileşimi karşılaştırmalı olarak incelemek, sonrasında oluşturulan üç boyutlu kültürler üzerinde kondrogenezisin gerçekleştirilmesi sonucunda hangi mezenkimal kök hücre kaynağının kondrosite daha iyi farklılaştığını belirlemek ve bu sonuçlar doğrultusunda kıkırdak doku mühendisliğinde kullanılmak üzere mezenkimal kök hüre kaynağı olarak en uygun kök hücre kaynağını önermektir. Tez kapsamında amaca ulaşmak için; adipoz, kordon matrisi ve olfaktör bulb dokularından elde edilmiş mezenkimal kök hücrelerin PCL scaffold yüzeyinde üç boyutlu hücre kültür modelleri 12 gün boyunca MTT (3-(4,5-dimetiltriazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolium bromid) ve Canlı/Ölü boyaması ile canlılık analizleri, CM-DiI boyaması ve SEM (Taramalı Elektron Mikroskop) görüntüleri takip edilerek optimize edilmiştir. Hazırlanan üç boyutlu hücre kültür modellerinde ki kondrojenik farklılaşma; MTT, Canlı/Ölü boyaması, NO (Nitrik Oksit) analizi, SEM görüntüleri, RNA izolasyonu ve cDNA eldesini takiben yapılan PZR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) ve Eş zamanlı PZR ve histolojik analizler ile 26 gün boyunca takip edilmiştir. Yapılan tüm bu çalışmalar sonucunda; kordon matrisi ve PCL scaffold ile hazırlanan üç boyutlu hücre kültür modelinin kondrojenik farklılaşmasının, adipoz doku ve olfaktör bulb kaynaklı mezenkimal kök hücreler ile hazırlanan hücre kültür modelinin kondrojenik farklılaşmasına göre daha hızlı gerçekleştiği tespit edilmiştir. Ayrıca yapılan eş zamanlı PZR ön çalışması sonucuna göre; olfaktör bulb kaynaklı mezenkimal kök hücre ve PCL scaffold ile hazırlanan üç boyutlu hücre kültür modelinde hiyalin kıkırdak gen ekspresyon özelliklerine benzer en yakın yapının elde edildiği görülmüştür. MTT ve NO analizi sonuçları istatistiksel olarak parametrik yöntemler olan ANOVA ve student t test ile belirlenmiştir. Tüm veriler Statistical Packages of Social Sciences (SPSS, version 19.0 for Windows) programı ile çalışılarak ve p<0,05 değeri istatistiki olarak anlamlı kabul edilmiştir. Sonuç olarak bu tez çalışması kapsamında ilk kez olarak; kondrogenez aşamasında adipoz, kordon matrisi ve olfaktör bulb gibi farklı kaynaklardan elde edilen mezenkimal kök hücreler ile PCL scaffold arasındaki etkileşim karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre; PCL'nin her üç kaynaktan elde edilen mezenkimal kök hücreler ile etkileşime girdiği, fakat en etkin sonucun olfaktör bulb kaynaklı mezenkimal kök hücreler ile olduğu belirlenmiştir. Ayrıca ilk defa olarak; kıkırdak doku mühendisliğinde, olfaktör bulb kaynaklı mezenkimal kök hücrelerinin PCL scaffold ile hazırlanan üç boyutlu kültür üzerinde kondrositlere farklılaştığı saptanmıştır. Bu sonuçlar; gelecekte kıkırdak doku mühendisliğinde kullanılmak üzere yeni bir mezenkimal kök hücre kaynağının kullanım potansiyelini ortaya çıkarmıştır. Anahtar Kelimeler: Scaffold, kıkırdak doku mühendisliği, mezenkimal kök hücreler