Endüstiryel olarak kullanılabilecek lipazları kodlayan genlerin zeytinden klonlanması

Abstract

Lipazlar, triglisertilerin hidrolizini katalizleyen hidrolazlardır. Hidroliz dışında esterleşme, ester değişimi, asidoliz, alkoliz, aminoliz gibi sentez reaksiyonlarını katalizleyebilen çok yönlü enzimlerdir. Bölge seçicilik, enantiyoseçilik ve stereoseçicilikleri ve yüksek stabiliteleri nedeniyle sayesinde organik kimyada, deterjan, ilaç, gıda, kozmetik, kâğıt, deri endüstrilerinde, biyodizel üretiminde kullanılırlar. Endüstride çoğunlukla mikrobiyal lipazlar kullanılmaktadır. Bitkisel lipazlarla ilgili az sayıda çalışma mevcuttur. Bitki lipazları genelde yüksek substrat özgüllüğü gösterirler. Bitki lipazları ile ilgili literatürdeki bilgilerin çoğu yağlı tohumlarla ilgilidir. Yağlı tohumlarda aktif lipazlar genellikle çimlenen tohumlarda bulunmuştur. Bununla beraber hint yağı lipazı gibi bazı lipazlar dormant tohumda aktif olarak bulunmuştur. Bunun dışında lateks lipazları da kullanım alan ve olanakları ile dikkat çekmektedir. Bu projede zeytinden lipaz enzimlerini kodlayan genlerin klonlanması amaçlanmaktadır. Bu amaçla RACE yöntemi kullanılmıştır. Öncelikle farklı bitkisel lipaz homologlarının dizileri kullanılarak EST veritabanı taranmış ve lipaza benzerlik gösteren 843 bp uzunluğunda bir zeytin contig dizisi bulunmuştur. Bu dizi kullanılarak 3’RACE primerleri tasarlanmış ve cDNA’nın 3’ ucu çoğaltılmıştır. Daha sonra 5’RACE yöntemi ile cDNA’nın 5’ ucu çoğaltılmıştır. Daha sonra RACE ile elde edilen dizi bilgisi kullanılarak tasarlanan primerler ile 1536 bp uzunluğundaki cDNA tek dizi olarak klonlanmıştır. Bu dizinin lipaza benzerliği BLAST programları ile doğrulanmıştır. Zeytin yaprak lipazının GXSXG lipaz ailesine dahil olduğu görülmüştür. Gerçek Zamanlı PZR analizleri soğuk stresinin ilk 24 saatinde lipaz relatif ekspresyon düzeyinin stres verilmemiş örneğe göre azaldığını göstermektedir. Onuncu günde ise ekpresyon düzeyi stres uygulanmamış örneklerdeki ekspresyon düzeyinin üzerine çıkmıştır. Pichia pastoris’te heterolog ekspresyon için farklı koşullarda ekspres denemeleri yapılmıştır. Yapılan aktivite deneylerinde enzimin pH 7’de çalıştığı belirlenmiştir. Optimizasyon çalışmaları sonunda tutarlı bir ekspresyon sağlanamamıştır.