Lactobacillus reuteri E81’de kodlanan glukansükraz ve glukanotransferaz enzimlerinin biyokimyasal karakterizasyonu, bu enzimler ile özgün prebiyotik oligosakkaritlerin üretimi

Abstract

Laktik asit bakterilerinin (LAB) starter kültür olarak işlevlerine ilave olarak son dönemde bu önemli mikrobiyal grubun ürettiği fonksiyonel metabolitler üzerinde durulmaktadır. Bu metabolitlerin başında da LAB türleri tarafından in situ olarak üretilip gıda maddelerinin fizikokimyasal niteliklerini geliştirebilen ekzopolisakkaritler gelmektedir. LAB türlerinde homopolimerik EPS üretimi ucuz substrat ve yüksek miktarda üretim nedeniyle temel olarak α-glukan üretimi çerçevesinde şekillenmektedir ve sükrozun substrat olarak kullanılması ile α-glukan üretiminden glukansükrazlar sorumludur. Son dönemde LAB türlerinde ortaya çıkartılan α-glukan üretebilen bir diğer enzim grubu da sükrozda inaktif ancak amiloz gibi α-1-4 glikozidik bağı içeren substratlara etki edip açığa çıkan glukoz ünitelerini farklı baglar ile bağlayabilen glukanotransferazlardır. Her iki enzim grubu ile de farklı yapılarda oligo/polisakkaritlerin üretimi gerçekleştirilebilmektedir. Bu bağlamda bu tez çalışması ile ekşi hamurdan izole edilen ve alternan üreticisi olduğu gösterilen L. reuteri E81’de alternan üretiminin ekşi hamur üretimi açısından fonksiyonel etkilerini ortaya koymak, alternan üretiminden sorumlu glukansükrazın ve yine aynı bakteride açığa çıkartılan 4,6- α-glukanotransferazın aktivitesinin sırasıyla verici-alıcı reaksiyonları ve farklı substratlarda üretebildikleri oligosakkaritlerin karakterizasyonu ve bu oligosakkaritlerin bağışıklık düzenleyici ve prebiyotik potansiyellerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Tez kapsamında kullanılan L.reuteri E81’in genom analizi bu bakteri de glukansükraz ve 4,6-α-glukanotransferaz enzimlerini kodlayabilecek genin yer aldığını göstermiştir. Tez çalışmasında ilk olarak ekşi hamur ve ekmeğinin nitelikleri açısından alternan üretiminin fonksiyonel etkilerinin anlaşılabilmesi için gtfA geni L. reuteri E81’den silinmiş, L. reuteri E81 ve alternan üretemeyen L. reuteri E81 ∆gtfA şusu ile ekşi hamur üretilip ekşi hamurun fizikokimyasal özellikleri ve ekşi hamur ekmeğinin yapısal karakteristikleri üzerine ˘ alternan üretiminin etkileri açığa çıkartılmış. İkinci olarak L. reuteri E81’den gtfA ve gtfB genleri E. coli BL21 hücrelerinde üretilip glukansükraz ve 4,6-α-glukanotransferaz enzimlerinin aktivitesi ortaya konmuş ve ürettikleri α-glukanların yapıları NMR spektroskopisi ile belirlenmiştir. Takiben glukansükraz enziminin sükroz ve farklı şeker alıcılarla ve 4,6-α-glukanotransferaz enziminin ise α bağı içeren farklı substratlardan üretebildikleri oligosakkaritler TLC, NMR ve LC/MS analizleri ile karakterize edilmiştir. Son olarak GTFA ve GTFB ile üretilen bu oligosakkaritlerin fonksiyonel etkileri in vitro olarak HT-29 kolon hücrelerinde IL-10, IL-4, IL-12 ve TNF-α sitokinlerini indüklenme potansiyelleri ve probiyotik ve patojen bakterilerin gelişimi üzerine potansiyel etkileri ortaya konmuş ve oligosakkarit düzeyinde fonksiyonel etkinin değişiklik gösterebildiği açığa çıkartılmıştır.