Bos taurus enolaz enzimi kodlayan genin yapıya dayalı ilaç tasarımı yönünde moleküler ve enzimatik analizlerinin yapılması

Abstract

Tropikal theileriosis, Theileria annulata parazitinin neden olduğu vektör kaynaklı vakalar arasında en yaygın görülen hastalıklardan biridir ve küresel ölçekte hayvancılık üretiminde ciddi ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Theileria annulata, Hyalomma cinsi kene vektörleri tarafından aktarılan ve özellikle Bos taurus ve Bos indicus olmak üzere ruminant hayvanlarda hastalığa neden olan bir zorunlu hücre içi protozoon parazitidir. Son yıllarda tropikal theileriosis tedavisinde başarı oranları düşüktür ve buparvaquona'a karşı direnç rapor edilmiştir. Son yıllarda gerçekleştirilen çalışmalarda Theileria annulata’nın Buparvaquona’a karşı direnç gösterdiğini ortaya koymaktadır. Bu sebeple Tropikal theileriosis ile mücadele alanında yeni tedavi yöntemi ve ilaç çalışmalarının artırılması gerekmektedir. Bu kapsamda 2017 yılında grubumuzda gerçekleştirilen bir tez çalışmasında bu hastalığa sebep olan Theileria annulata enolazına karşı yapıya dayalı ilaç tasarım çalışmaları gerçekleştirilmiştir ve Theileria annulata’nın temel enerji metabolizmasındaki glikoliz yolağında önemli bir enzim olan enolaz hedef alınarak bu enzimi inhibe eden kumarin türevleri taranmıştır. Bu tez çalışmasında 38 kumarin türevi arasında yüksek T. annulata enolazın inhibisyon aktivitesine sahip (IC50<15 μM) kumarin türevleri; K8 (6,7-dihidroksi-4-(3,4- dimetoksifenil)-kumarin), K9 (7,8-dihidroksi-4-(3,4-dihidroksifenil)-kumarin), K21 (6,7- dihidroksi-4-(3,4-dihidroksifenil)-kumarin) ve K23 (7,8-dihidroksi-3-(3,4-dihidroksifenil)- (kumarin) olarak belirlenmiştir. Bir etken maddenin ilaç olarak kullanılabilmesi için söz konusu bileşiğin parazit hedef molekülünü inhibe etmesi ama konak organizmadaki eşdeğer molekülü inhibe etmemesi gerekmektedir. Bu amaçla gerçekleştirilen bu tez çalışmasında parazitin konağı Bos taurus’ta eşdeğer enzim olan enolazın yapıya dayalı ilaç tasarımı yönünde yapısal, moleküler ve enzimatik analizleri yapılmıştır. Bu tez çalışmasında Bos taurus enolazını (BtEno3) ifade eden gen klonlanmış, eksprese edilmiş ve protein % 95 saflıkta afinite kromatografisi ile başarıyla saflaştırılmıştır. Sıcaklığın ve pH değişimlerinin enzim aktivitesine etkisi analiz edilmiş ve optimum koşullar 40 °C, pH 6.5 olarak belirlenmiştir. BtEno3’ın biyokimyasal özellikleri karakterize edilmiştir ve literatürde ilk defa enzimin kinetik parametreleri Vmax ve Km sırasıyla 0,01305 μmol/dk ve 0.514 mM olarak hesaplanmıştır. Ayrıca, in siliko analizlerde kullanılmak üzere Bos taurus enolazının 3 boyutlu yapısı homoloji modellemesi ile oluşturulup kumarinler ve substrat moleküler yanaştırma metodları ile enolaza yanaştırılmıştır. Enzim-substrat, enzim-kumarin ve enzim-kumarin-substrat komplekslerindeki etkileşimler 100 ns boyunca moleküler dinamik yöntemler ile simule edilerek analiz edilmiştir. Enzim-substrat arasındaki etkileşimlerin, mayada deneysel olarak belirlenen etkileşimler ile aynı olduğu belirlenmiştir. Substratın ve kumarin türevlerinin enzime tahmini serbest bağlanma enerjileri MM-GB(PB)SA metodları ile hesaplanmıştır. T. annulata parazitinin enolazını yüksek etkili olarak inhibe eden K8, K9, K21 ve K23 kumarin türevlerinin Bos taurus enolazının aktivitesine etkisi in vitro olarak çalışılmıştır ve bu kumarin türevlerinin Bos taurus enolazını T. annulata enolazına kıyasla daha düşük konsantrasyonlarda inhibe ettiği belirlenmiştir (K8 100 μM konsantrasyonda %36,87, K9 100 μM konsantrasyonunda %8,13 inhibisyon, K21 IC50: 77,69 μM ve K23 IC50:84,42 μM). In vitro ve in siliko çalışmalar birlikte değerlendirildiğinde parazit enolazını inhibe eden K8, K9, K21 ve K23 türevlerinin parazit konağındaki eşdeğer enolazını daha yüksek kumarin türevi konsantrasyonlarda inhibe ettiği görülmüştür. Bu kumarin türevlerinin inhibisyon oranları K21>K23>K8>K9 olarak sıralanmıştır. Kumarin türevleri BtEno3’a bağlandıktan sonraki enzimin aktif bölgesindeki konformasyon değişikleri, enzimsubstrat ve enzim-kumarin etkileşimleri in siliko analiz edilmiştir. Kumarinlerin enzimin aktif bölgesine bağlanmadığı, bağlandığı oyuklarda sıkı bağlar oluşturmadağı ve aktif bölgede herhangi bir konformasyon değişikliğine sebep olmadığı belirlenmiştir. Enzimsubstrat etkileşiminde koordinasyon eksikliğine sebep olmadığı in siliko çalışmalar sonucunda ortaya konmuştur. Bu tez çalışmasında gerçekleştirilen in vitro ve in siliko çalışmaların sonucunda K8 ve K9 kumarin türevlerinin parazit enolazını konak enolazına kıyasla çok daha etkili olarak inhibe ettiği belirlenmiştir. Belirlenen bu türevler ile Theilerisosis tedavisine yönelik yeni ilaç adayı geliştirme yönünde hücre kültürü ve pre-klinik çalışmaların önün açacaktır.