Alfa-amilaz ve alfa amilaz-dekstran konjugatların spektrofluorometrik yöntemle incelenmesi

Abstract

Nişastayı a-(l,4) glikozid bağlanndan kırarak glukoz birimlerine parçalayan a-amilaz enzimi(l,4-a-glukan 4-glukanohidrolaz, EC 3.2.1.1) gıda, deterjan, kağıt ve tekstil gibi bir çok sanayii alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. a-Amilazlar substratta iç kısımdaki bağlara daha yüksek ilgi gösteren endohidrolazlardır. Molekül ağırhklan 50.000 dolayında olan a-amilazlar 478 amino asid artığı içermektedirler ve S adet alt ünite bulundurmaktadırlar. Bu çalışmada, ticari önemi olan ve en çok incelenen amilaz türlerinden Aspergillus oryzae a- amilazı (TAKA) kullanıldı. Farklı pH değerlerine aktrvite tayinleri yapılarak optimum pH aralığı belirlendi. SDS-PAGE elektroforezi uygulanarak enzimin ah üniteleri ve saflık durumu hakkında bilgi edinildi Ayrıca farklı pH değerlerinde gerçekleştirilen doğal elektroforez işleminde enzimin davranışları gözlendi Steady-state spektrofluorometre ile a-Amilaz çözeltilerinin pH ve sıcaklık değerleri değiştirilerek emisyon spektrumlan alındı. Bu spektrumlarda gözlenen maksimum noktalarında fluoresans şiddetleri okundu ve dalga boyu kaymaları kaydedildi 'Time-Master' spektrofluorometre kullanılarak farklı pH ve sıcaklıklarda TRES ve bozunma(decay) grafikleri almdı. Elde edilen emisyon bozunma grafiklerinden fluoresans ömürleri hesaplandı. Böylece enzim molekülünün çözeltideki durumu ve daha karalı olduğu koşullar hakkında bilgi edinildi Daha stabil bir enzim elde etmek üzere, a-amilaz-Dekstran mol oranlan 10,20,30 alınan enzim-polimer konjugatlan yapıldı Yukarıda belirtilen yöntemler kullanılarak konjugatlann özellikleri inceltendi Bu durumda enzimin maksimum aktrvite gösterdiği pH değerinin daha asidik bölgede olduğu görüldü. Konjugatlann "steady-state" spektrofluorometre ile belirlenen fluoroseans karakteriktislerinin, enzim için elde edilenden farklı olduğu görüldü.