Gosspypium hirsutum format dehidrogenaz enziminin oksidatif stabilitesinde yüzey metionin kalıntılarının etkisinin araştırılması

Abstract

Optikçe saf kiral bileşiklerin eldesi hem ürün kalitesi hem de insan sağlığı için önemlidir. Kimyasal yöntemlerle elde edilen kiral bileşikler sonucunda rasemik karışımlar elde edilmektedir. Rasemik karışımlar farmasötik, gıda, tarım gibi optik olarak saf ürün gerektiren sektörlerde problem yaratmaktadır. Kiral moleküllerin sentezinde kimyasal yöntemler yerine enzimlerin kullanılması optikçe saf ürünlerin eldesine imkân sağlamaktadır. Endüstriyel üretimde, optikçe saf kiral ürün eldesinde oksidoredüktaz grubu enzimler kullanılmaktadır. Ancak bu enzimlerin kullanımı için oldukça pahalı bir koenzim olan NAD(P)H gerekmektedir. NAD+ bağımlı format dehidrogenazlar, formatı CO2‘e okside ederken; NAD+’nin NADH’e indirger ve NADH varlığında ise, CO2’in indirgenmesini katalizlerler. Bu nedenle pahalı bir koenzim olan NAD(P)H’ın rejenerasyonu ve CO2’den hidrojen yakıtının stabilize bir formu olan formik asit üretimi araştırmalarında önemlidir. Bitkilerde çevresel stres koşulları ile mücadelede anahtar rol oynayan FDH enzimi ıslah çalışmaları için de önemlidir. Literatürdeki CbFDH, PsFDH, SoyFDH gibi rekombinant enzimlerinin gerek aktivite gerekse kararlılıkları açısından geliştirilmesi gerekmektedir. Bu nedenle yeni FDH’lerin araştırılması ve geliştirilmesi önemlidir. Mikrobiyal kaynaklı FDH’ler hakkında geniş bir literatür bulunmakla beraber, bitkisel FDH’lerin biyoteknolojik potansiyeli yeteri kadar değerlendirilmemiştir. Protein yüzeyindeki metionin amino asitleri oksidatif strese karşı hassastır ve reaktif oksijen türleri ile metionin sülfokside dönüştürülebilirler. Bu nedenle proteinin konformasyonunun değişmesinde ve aktivitesinin kaybolmasında kritik bölgelerdir. Sülfür grubu nedeniyle oksidasyona meyilli metioninin, oksidasyona dirençli bir lösin amino asidi ile değiştirilmesi oksidatif kararlılığın arttırılmasında önemli bir stratejidir. Bu yüksek lisans tezinde yönlendirilmiş mutagenez yöntemi ile GhFDH protein yüzeyinde M225L, M234L, M243L, M225/243L ve M225/234/243L mutasyonları yapılarak yüzey metioninlerinin oksidatif kararlılığa olan etkisi araştırılmıştır. Sonuçlar, M234L (0,72 s − 1 mM − 1) ve M225/234/243L (0,55 s − 1 mM − 1), yabanıl tipten daha yüksek katalitik etkinliğe sahip olduğunu göstermiştir. Kimyasal kararlılıkta en dikkat çekici sonuçlar, ikili ve üçlü mutantlarda görülmüştür. M225/243L ve M225/243L/234L, kef in faktörünü (sırasıyla 12,3x10-5 ve 12,8x10-5 s-1) azaltmıştır.