Hypocrea jecorina QM9414'den pullulanazın saflaştırılması

Abstract

Bu çalışmada Viyana Teknik Üniversitesi, Biyokimyasal Teknoloji ve Mikrobiyoloji Enstitüsü'nden temin edilen Hypocrea jecorina QM 9414'de ilk defa pullulanaz indüksiyonu gerçekleştirildi. Enzim indüksiyonu için optimum şartlar tayin edildi. Bu mikroorganizmadan pullulanaz [EC 3.2.1.41] ilk kez saflaştırıldı. Saflaştırılan enzimin bazı özellikleri incelendi.Pullulanaz, H. jecorina QM 9414'den homojenizasyon, amonyum sülfat çöktürmesi, DEAE-selüloz ve Sefadeks G-100 kolon kromatografisi yöntemleriyle 11 kat saflaştırıldı. Saflaştırma işlemi süresince sıcaklık +4ºC'de tutuldu. Protein miktar tayini Bradford ve Warburg-Christian yöntemlerine göre, enzim aktivitesi ise 37ºC'de Miller'in yöntemine göre, 540 nm dalga boyunda spektrofotometrede tayin edildi.H. jecorina pullulanazının PAGE sonucunda 130,56 kDa mol ağırlığına karşılık gelen tek aktivite bandı gösterdiği saptandı. SDS-PAGE sonucunda ise bu enzimin monomer yapıda olduğu bulundu. Enzimin optimum sıcaklığı 35?C-65?C arasında belirlendi. Hypocrea jecorina pullulanazının optimum pH'sı substrata göre değişiklik gösterdi. Optimum pH, amilopektin ve pullulan için 6,5, nişasta için 5,0 olarak bulundu. Enzim tarafından katalizlenen reaksiyonun aktivasyon enerjisi 0,6178 kcal.mol-1 olarak hesaplandı. Enzimin amilopektin, nişasta ve pullulan substratlarına karşı Km değerleri sırasıyla 10,7 mg/ml, 15,5 mg/ml ve 38,4 mg/ml, Vmax değerleri ise sırasıyla 3,3145 ?A/dk, 3,3211 ?A/dk ve 3,818 ?A/dk olarak bulundu.