Alzheimer amiloid beta peptidine ait farklı amino asid dizilerinin polielektrolitler ile konjugasyon reaksiyonlarının incelenmesi

Abstract

Amiloid terimi, özellikle son yıllarda bilim dünyasında önemli bir araştırma konusu haline gelmiştir. Bunun en önemli sebebi, Alzheimer hastalığına neden olan en önemli etkenlerden birinin amiloid beta birikimlerinin meydana gelmesidir. Alzheimer hastalığı, yanlış katlanmış olan Amiloid Beta peptidlerinin beyinde plaklar şeklinde birikim oluşturması sonucu meydana gelmektedir. Bu plaklar genellikle 39-43 amino asitten oluşan ve amiloid beta (Aβ) denen küçük peptid dizilerinden oluşmaktadır. Aβ çok daha büyük bir protein olan ve amiloid öncül protein (APP) olarak bilinen daha büyük bir proteinin çeşitli enzimlerle parçalanması sonucu meydana gelir. Sonuç olarak oluşan Aβ peptid fragmentleri sinir hücrelerinin dışında birikerek senil plaklar denilen yapıları oluştururlar. Bu tez çalışmasında, çağımızın en önemli hastalıklarından biri olarak görülen Alzheimer hastalığına ait peptid bazlı aşı modeli, tanı kiti geliştirilmesi gibi alanlarda kullanılabilecek biyolojik aktiviteye sahip peptid- makromolekül biyokonjugatları ve fiziksel kompleksleri geliştirilmesi amaçlanmıştır. Amiloid beta (Aβ) peptidinin antijenik özellikteki 2 farklı amino asid dizisi ticari olarak satın alınmıştır. Her iki peptid dizisi ayrı ayrı 4 farklı taşıyıcı makromoleküle farklı mekanizmalar ve bağlanma dereceleri ile hem kovalent olarak bağlanmış, hem de bu taşıyıcılar ile fiziksel kompleksleri elde edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan taşıyıcı makromoleküller şunlardır: Poliakrilik asid (PAA), [Poli(N-vinil-2-pirolidon-ko-akrilikasid) veya VPAA], Dekstran aldehit (DA) ve Bovin Serum Albumin (BSA)'dir. Bu taşıyıcı moleküllerden PAA ve BSA ticari olarak alınmış olup, VPAA ve DA ise bölümümüzde sentezlenmiş ve karakterizasyonları yapılmıştır. Her iki peptid dizisinin de amino ucuna Triptofan amino asidi eklenerek bu peptidlere floresans özellik kazandırılmıştır. Böylelikle peptidlerin ve daha sonra sentezlenen biyokonjugatların florosans spektrofotometre cihazı ile incelenmesine olanak sağlanmıştır. Sentezlenen bütün biyokonjugat ve komplekslerin fizikokimyasal yapıları incelenmiş ve karakterizasyonları yapılmıştır. Biyokonjugat ve komplekslerin oluşumu, farklı spektroskopik ve kromatografik yöntemlerle aydınlatılmıştır. Elde edilen sonuçlar kıyaslandığında, sulu çözeltide karbodiimid varlığında kovalent bağlar ile oluşan biyokonjugatların daha verimli ve güçlü bağlandığı görülmüştür. Konjugasyon reaksiyonunun oluşumu sırasında floresans boya kullanılarak Floresans Rezonans Enerji Transferi (FRET) yöntemi yardımı ile; intermoleküler mesafe hesabı yapılıp, biyokonjugattaki donör ve akseptör arasındaki mesafe hesabı ile elde edilen bilgiler, saf peptidin konformasyonu ve biyokonjugat oluşumu durumunda peptidin konformasyonundaki değişimler hesaplanmış ve sayısal değerlerle de ifade edilmiştir. Ayrıca literatürde ilk kez Trp içeren Amiloid beta (1-21) peptid dizisi modellenmiş, moleküler mekanik yöntem ile minimum enerjiye sahip olduğu optimize geometrisi belirlenmiştir. FRET yöntemi ile deneysel verilere dayalı elde edilen sayısal değerlerin, teorik olarak hesaplanan değerler ile örtüştüğü ispatlanmıştır. Sentetik aşı modeli olarak tasarladığımız Amiloid beta (Aβ) peptidinin-taşıyıcı makromolekül biyokonjugatları için; in vivo uygulamalarda kullanılan düşük konsantrasyonlarda MCF-7 hücreleri üzerinde yapılan çalışmalarda elde edilen biyokonjugatların özellikle düşük dozlarında önemli derecede toksik bir etki göstermediği ortaya konulmuştur. Ayrıca bu biyokonjugatlarla yapılan MTT deneyleri ile hücre canlılık oranları da kontrol edilerek, IC50 değerleri hesaplanmıştır. Tez kapsamında hücre kültürü ile ilgili yapılan bir diğer çalışmada ise, her iki peptid dizisine ait farklı konsantrasyonlarında sentezlenmiş olan fiziksel kompleksler ve biyokonjugatlar, tek başına taşıyıcı makromoleküller ve tek başına peptid dizileri, işaretleme gerektirmeden, 72 saat boyunca gerçek zamanlı (real-time) ölçüm alan yeni bir yöntem olan XCELLienge Sistemi ile İnsan Umbilikal Ven Edotel Hücreleri (HUVEC) hücrelerine uygulanmış ve bu maddelerin hücrelerin çoğalma hızına etkileri ve toksik etkileri incelenmiştir. Biyokonjugat ve fiziksel kompleksin HUVEC üzerindeki etkileri kıyaslandığında ise, özellikle kovalent bağla bağlanmış olan biyokonjugatların hücre çoğalması üzerinde önemli bir negatif etkisinin olmadığı görülmüş ve hem MCF-7 ile hemde HUVEC ile yapılan hücre çalışmaları sonucunda elde edilen veriler ile de biyokonjugatların deney hayvanları üzerinde kullanılabilirliği ortaya konulmuştur. Böylece bu tez kapsamında sentezlenen konugatların Aβ'nın Alzheimer hastalığına karşı spesifik antikorlarının elde edilmesi, nanobiyosensörlerinin oluşturulması, tanı kitlerinin ve biyoteknolojik aşılarının geliştirilmesine ışık tutacak bir çalışmadır.