Pamuk bitkisinden izole edilen nikotinamid adenin dinükleotid bağımlı format dehidrogenazın stabilitesinin arttırılması

Abstract

NAD+ bağımlı format dehidrogenazlar (FDH, EC 1.2.1.2), kiral moleküllerin sentezi için kullanılan ve pahalı bir koenzim olan NAD(P)H' nin yenilenmesi için özellikle farmasötik endüstrisinde önemli enzimlerdir. Bununla birlikte, FDH enzimleri, stabilite yetersizliği nedeniyle, biyotransformasyon koşulları altında hızlı bir aktivite kaybı göstermektedir. Enzim stabilitesi, endüstriyel biyotransformasyon işlemlerinin gelişimi için sınırlayıcı bir faktördür. Biyotik ve abiyotik stres koşullarında bitki büyümesi üzerindeki etkileriyle ilgili çok sayıda veri bulunmasına rağmen, bitki kaynaklı rekombinant FDH' lerin stabilitesi konusundaki bilgimiz sınırlıdır. Bu durum bitki kaynaklı FDH' lerin biyoteknolojik potansiyelinin değerlendirilmesini de kısıtlamaktadır. Bu nedenle, çalışmamızda Gossypium hirsutum' dan izole edilen NAD+ bağımlı FDH' nin (GhFDH) stabilitesini geliştirmek amacıyla bölgeye yönelik mutagenez yöntemi kullanılmıştır. GhFDH yapısında bulunan 3 metiyonin amino asidi oksidatif strese dayanıklı lösin amino

asidi ile yer değiştirilerek bu değişimlerin enzimin katalitik özelliklerine ve stabilitesine olan etkisi araştırılmıştır. Metiyonin-lösin değişimi için rekombinant GhFDH enziminin M258, M294 ve M299 konumları seçilmiştir. Mutant GhFDH proteinlerin homoloji modellerinin yapılmasının ardından aktivite ve stabilite deneyleri yapılarak bu mutasyonların protein aktivitesi ve stabilitesi üzerindeki etkileri değerlendirilmiştir. M294L ve M299L mutant enzimlerinin aktivite göstermeme nedeninin bu konumlardaki metiyonin amino asitlerinin katalitik aktivite için önemli olan amino asitler ile kritik etkileşim içinde olduklarını ve bu nedenle enzimin katalitik aktivitesinin kaybına sebebiyet verdiklerini düşündürmektedir. M258L mutantının katalitik aktivitesi (kcat / Km) yabanıl GhFDH’ e kıyasla 0.39 s-1 mM-1‘ dan 0.29 s-1 mM-1’ a düşmüştür. Stabilite deneyleri sonucu M258L mutasyonunun termal stabilitede 6 0 C’ lik bir düşüşe neden olduğunu göstermektedir. Oksidatif stabilite deneyleri sonucunda ise 50 mM H2O2’ de yabanıl tip GhFDH’ e göre önemli bir fark göstermese de, 100 mM’ lık H2O2 ’ a maruz bırakılan M258L mutantının yabanıl GhFDH den 2 kat daha fazla süre aktivitesini koruduğu tespit edilmiştir. Oksidatif stabilitesinde görülen bu sonuç M258L mutantının geliştirilmek için umut vaadedici olduğunu ortaya koymaktadır. Çoklu mutasyonlar ve CD ölçümleri ile yapısal analizler yapılarak mutasyonların enzimin aktivite ve stabilitesine olan etkisi incelenmelidir.