Zeytin (Olea europaea L.) yaprağından ß-glukozidaz enzimini kodlayan genin klonlanması

Abstract

Aile 1 enzim sınıfına ait olan ß-glukozidazlar, ß glikozidik bağların hidrolizini kataliz ederler. Bitkilerde hücre duvarı lignifikasyonu, fitohormonların aktivasyonu ve kimyasal savunma bileşiklerinin aktivasyonu gibi pek çok önemli görevde rol alırlar. Daha önceki bir çalışmada, zeytin (Olea europaea L.) bitkisinden yaprak örnekleri kullanılarak 2.4X106 bağımsız klon içeren bir cDNA kütüphanesi kurulmuştur. Bu çalışma sonucunda elde edilen gen dizileri Phrap ve CAP3 programları kullanılarak kontig ve singletler oluşturulmuştur. Biyoteknolojik uygulamalara uygun olan genlerin araştırılması sonucunda bitkilerde ß-glukozidaz enzimini kodlayan genle homoloji gösteren bir kontig dizisi tanımlanmıştır. Bu çalışmada, daha önce elde edilen contig dizi bilgisinden yola çıkarak zeytin yapraklarından tam uzunlukta ß-glukozidaz cDNAsı izole etmek ve klonlamak amaçlanmıştır.ß-glukozidaz homologlarını kodlayan genlerin soğuğa bağlı olarak fazla ekspresyon gösterdikleri bilinmektedir, bu nedenle soğuk stresine maruz kalmış zeytin yapraklarından total RNA izole edildi. Elimizdeki kontig dizin bilgisinden yararlanılarak ileri ve geri primerler tasarlandı. Tam uzunlukta cDNA elde etmek için bu primerler kullanılarak RT-PCR uygulandı ve 1700 bp uzunluğunda bir fragment elde edildi. Fragment klonlandı ve dizin analizine gönderildi. Dizinimizin BLASTN ve BLASTP analizleri sonucunda, zeytin ß-glukozidaz dizinine %98 benzerlik gösterdiği sonucuna varıldı.Tam uzunlukta cDNA elde edildiğinde, devam etmekte olan bir projenin sonraki aşamalarında cDNA'lar Pichia ekspresyon vektörüne klonlanacak ve Pichia pastoriste eksprese edilecektir.