Gossypium hirsutum format dehidrogenaz enzimi üzerine bölge doygunluk mutasyonu uygulamaları

Abstract

NAD+-bağımlı format dehidrogenazlar (FDH, EC 1.2.1.2) metilotrofik mikroorganizmalar ve yüksek bitkilerde yaygın olarak bulunan enzimlerdir. FDH enzimi NAD(P)+ varlığında formatın CO2’e oksidasyonunu katalizlerken NAD+’ın NADH’a indirgenmesini ve uygun şartlarda NADH varlığında ise ters yönde, CO2’in indirgenmesini katalizleyebilmektedir. Dolayısıyla hem CO2 indirgeme reaksiyonlarının geliştirilmesinde hem de kiral moleküllerin optikçe saf olarak sentezlenmesi sırasında kullanılan NAD(P)H koenziminin yeniden elde edilmesinde önemli enzimlerdir. Literatür incelendiğinde, NAD+-bağımlı FDH enzimleri ile ilgili çalışmaların mikroorganizmalar üzerinde yoğunlaştığı, bitki FDH’leri ile ilgili protein mühendisliği çalışmalarının oldukça az olduğu görülmektedir. Bu nedenle pamuk (Gossypium hirsutum L.) bitkisinden izole edilerek E.coli konakçı hücresinde rekombinant olarak üretilebilen Gossypium hirsutum NAD+-bağımlı FDH (GhFDH) enziminin NAD(P)H rejenerasyonunda kullanılma potansiyelinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. FDH enzimleri genellikle NAD+ koenzimine karşı kesin bir spesifite göstermekle birlikte GhFDH’in NADP+’ye karşı da bir afinite gösterdiği tespit edilmiştir. Belirlenen bu NADP+ afinitesi GhFDH enziminin NAD(P)H rejenerasyonu için geliştirilmeye değer olduğunu göstermektedir. NADP+ afinitesi gösteren bir FDH enziminin elde edilmesi endüstriyel olarak en az NADH kadar sıklıkla kullanılan NAD(P)H koenziminin rejenerasyonu için önemlidir. Bugüne kadar FDH enziminin koenzim spesifisitesinin değiştirilmesine yönelik çalışmalar sonucunda NADP+ molekülüne kısmi aktivite gösteren birkaç mutant enzim elde edilmiştir. Bu çalışmada Bölge Doygunluk Mutasyonu yöntemi kullanılarak GhFDH enziminin koenzim spesifitesinin genişletilmesi hedeflenmiştir. Elde edilen mutasyonların koenzim spesifitesinin yanı sıra, substrat spesifitesi, enzim aktivitesi ve termal kararlılığı üzerine olan etkileri de incelenmiştir. GhFDH’de koenzim spesifitesi açısından önemli bir bölge olduğu bilinen N184 amino asidine uygulanan Bölge Doygunluk Mutasyonu ile hedef bölgede mutasyonlar içeren bir akıllı kütüphane elde edilerek mutant GhFDH’ler karakterize edilmiştir. Kütüphanenin aktiviteye bağlı olarak taranması sonucunda hedef bölgedeki N184R ve N184H hedef mutasyonlarına ek olarak farklı iki mutant (D123A ve E198G) daha tespit edilmiştir. Taramalar sonucu seçilen bir başka mutantta ise sadece nükleotid değişimi gerçekleştiği, amino asidin aynı kaldığı görülmüştür (N184N, AACAAT). N184R mutantının katalitik aktivitesi (kcat/Km) koenzim olarak NAD+ kullanıldığında yabanıl tip GhFDH’e göre 0.39 s-1mM-1’dan 0.0048 s-1mM-1’a düşmüştür. NADP+ koenzimi kullanılarak yapılan aktivite ölçümlerinde N184R’nin katalitik aktivitesi yabanıl tip GhFDH’e göre 0.0042 s-1mM-1’dan 0.00049’a düşüş göstermiştir. Yabanıl tip GhFDH’in termal kararlılığı (T0.5) 53.8oC iken, N184R için 50.37oC olarak hesaplanmıştır. N184H mutantının katalitik aktivitesi NAD+ kullanıldığında 0.017 s-1mM-1 olarak ölçülürken, NADP+ kullanıldığında katalitik aktivite 0.00049 s-1mM-1 olarak belirlenmiştir. Termal kararlılık ise N184H için yabanıl tip GhFDH’e göre yaklaşık 1oC düşüş göstermiştir. Bununla birlikte hedef dışı rastlanan iki mutasyon noktası olan D123A ve E198G’de herhangi bir aktivite elde edilmemiştir. İleriki çalışmalarda ikinci tur bölge doygunluk mutasyonu ve koenzim spesifitesi için önemli olduğu bilinen farklı residulara bölge doygunluk mutasyonu uygulanarak, NADP+ spesifitesi için önemli bir potansiyele sahip olan GhFDH enziminin koenzim tanıma aralığının genişletilebileceği düşünülmektedir.