Halofilik arkeal kaynaklı lipaz üretim koşullarının optimizasyonu ve aktif lipazın saflaştırılması

Abstract

Lipazlar, enzim sınıflandırmasında hidrolazlar grubunda yer alan, triaçilgliserollerin serbest yağ asitlerine ve gliserole hidrolizini katalizleyen enzimlerdir. Endüstriyel lipazlar, genellikle hücre dışı lipaz üreten mikroorganizma türlerinden sağlanır. Mikrobiyal lipazlar çoğunlukla sıvı kültür ortamlarında üretilirler ve aktiviteleri karbon/azot kaynaklarının tür ve derişiminden, ortam pH’ından ve sıcaklıktan etkilenir. Ekstremofilik organizmalar, moleküler adaptasyonları sayesinde ekstrem koşullar altında stabil ve aktif enzimler (ekstremozimler) sentezleme yeteneğine sahip olduklarından, önemli biyoteknolojik potansiyelleri bulunmaktadır ve bilimsel açıdan büyük ilgi çekmektedirler. Bu çalışmada, lipaz kaynağı olarak Türkiye Tuzköy Madeni’nden izole edilen, ekstrem halofilik arkea olan Haloarcula hispanica 2TK2 suşu kullanılmıştır. Halofilik arkealar, çok yüksek tuz konsantrasyonlarına ve ekstrem koşullara kolayca adapte olabilme özelliğine sahiptirler. Bu çalışmada lipaz üretiminde önem taşıyan ortam parametrelerinden karbon kaynakları ve tuz konsantrasyonu incelenmiş, Haloarcula hispanica için en uygun lipaz üretim parametreleri tespit edilmiştir. Karbon kaynağı olarak çeşitli yağların (zeytinyağı, susam yağı, aynısafa yağı, kudret narı, çuha çiçeği yağı, ceviz yağı ve balık yağı), yağ asidi esteri tribütirinin ve yağ asidi esterleri stearik asit ve oleik asidin, yağların farklı derişimlerinin ve tuz konsantrasyonunun (3M, 4M ve 5M NaCl) hücre dışı lipaz aktivitesine etkisi incelenmiştir. Optimum lipaz üretim koşullarını belirlemek amacıyla, bu parametreler kullanılarak farklı besiyerleri (pH=7,5) hazırlanmış, ekim işlemi yapılmış ve 40°C’de 60 gün boyunca inkübe edilmiştir. İki günde bir düzenli olarak numune alınarak, titrasyon yöntemiyle lipaz aktiviteleri takip edilmiştir. Yapılan deneyler sonucunda Haloarcula hispanica’nın hücre dışı lipaz ürettiği, üretim ortamına katılan bazı yağların lipaz üretimini tetiklediği, en uygun karbon kaynaklarının %2 derişimde ceviz yağı ve balık yağı, %1 oranında stearik asit ve tribütirin olduğu, en uygun tuz konsantrasyonunun 4M NaCl olduğu tespit edilmiştir. Üretilen lipaz enzimi, amonyum sülfat çöktürmesi ve ultrafiltrasyon işlemleriyle kısmi olarak saflaştırılmış, enzimin optimum çalışma koşullarını belirlemek amacıyla farklı sıcaklık, pH ve tuz konsantrasyonlarında aktivite tayinleri yapılmıştır. Optimum sıcaklık ve pH değerleri sırasıyla 45°C ve 8,0 olarak saptanmıştır. Farklı tuz konsantrasyonlarında enzim aktivitesi ölçülmüş, optimum aktivitenin tuzsuz ortamda gerçekleştiği, tuz konsantrasyonu arttıkça aktivitede bir miktar düşme olduğu ancak 5M tuz konsantrasyonunda aktivitesinin %85’ini koruyarak aşırı tuzlu ortamlarda stabilite gösterdiği belirlenmiştir. Bunu yanı sıra, elde edilen lipaz enziminin Triton X-100 ve SDS yüzey aktif maddelere karşı direnci araştırılmış ve deterjan endüstrisindeki kullanım potansiyeli ortaya konmuştur. Kısmen saflaştırılmış olan lipaz, deterjan katkıları varlığında aktivitesini büyük oranda koruyabildiği için üretilen enzimin deterjanlarda kullanım potansiyeline sahip olduğu düşünülmektedir.