Zeytin beta lukozidaz geni'nin pichia pastoris'te ekspresyonu

Abstract

Beta glukozidazlar (EC.3.2.1.21) glikozidler ve oligosakkaritlerin beta glukozidik bağlarının hidrolizini katalizleyen enzimlerdir. Bitkiler, hayvanlar, bakteriler ve mantarlarda bulunurlar. Hayvanlarda glikolipidlerin ve egzojen glikozidlerin yıkımı, mikroorganizmalarda biyokütle dönüşümü, bitkilerde koku salınımı, lignifikasyon, hücre duvarı oligosakkaritlerinin katabolizmasında önemli rol oynarlar. Beta glukozidazların zeytinde tat ve renk oluşumunda görevli olduğu düşünülmektedir. Çeşitli rekombinant proteinlerin üretiminde kullanılan bir organizma olan Pichia pastoris, beta glukozidaz ekspresyonu çalışmalarında da sıklıkla kullanılmaktadır. Ökaryotik protein üretiminde gerekli olan post translasyonel modifikasyon, protein katlanması ve protein işlenmesini sağlayan Pichia pastoris, yüksek düzeyde protein üretiminin yanı sıra diğer ökaryotik ekspresyon sistemlerine göre daha ucuz, daha kolay ve hızlı üretilebilme avantajına sahiptir. Bu çalışmada; enzimin büyük miktarda üretimi için Pichia pastoris'te, zeytin (Olea europaea L. Gemlik kültivarı) beta glukozidaz geninin heterolog ekspresyonu amaçlanmıştır. Tam boyda beta glukozidaz cDNA'sı, alkol oksidaz (AOX1) promotoru kontrolü altında maya mekik vektörü pPICZB içine klonlanmıştır. Oluşturulan rekombinant DNA, Pichia pastoris'in yabani tip X-33 suşuna kimyasal transformasyon ile aktarılmış ve transformantlar YPDS/Zeo içeren besiyerlerinde seçilmiştir. Zeytin beta glukozidaz geninin P. pastoris genomuna entegrasyonu hem ilgili gene özgü hem de AOX primerleri ile kurulan PCR sonucunda doğrulanmıştır. Kültürler 30°C ve 250 rpm'de farklı besiyerlerinde büyütülmüş ve her gün %1 metanol ilavesi yapılarak heterolog beta glukozidaz ekspresyonu indüklenmiştir. Dört gün boyunca toplanan örneklerdeki rekombinant beta glukozidaz ekspresyonu, yapay substratlarla enzim aktivitesinin belirlenmesi ile analiz edilmiştir. Gelecek çalışmalarda üretilen rekombinant enzimin saflaştırılması ve biyokimyasal karakterizasyonu amaçlanmaktadır.