Zeytin ( Olea europaea L. cv Gemlik ) bitkisinde korunmuş miRNA’ların analizi

Abstract

Zeytin (Olea europaea), zeytingiller (Oleaceae) ailesinden meyvesi yenen Akdeniz iklimine ait bir ağaç türüdür. Zeytin meyvesi fosfor, potasyum, kalsiyum, magnezyum mineralleriyle birlikte, A,D,E,K vitaminlerini içermektedir. Zeytinyağının kanser oluşumunu engellediği ve radyoaktiviteye karşı hücreleri koruduğu tespit edilmiştir. Zeytinyağı, önemli ölçüde antioksidan içermesi ve yüksek sıcaklıklara dayanıklı olması açısından da önem teşkil etmektedir. Doymamış yağ asitlerince zengin olan, şeker ve kalp-tansiyon hastaların diyeti için oldukça önemli olduğu bilinen zeytinin daha iyi anlaşılabilmesi için üzerinde moleküler düzeyde çalışma yapılması gerekmektedir. Bu çalışmada, zeytin bitkisinde mikro RNA’ların incelenmesi amaçlanmıştır. MikroRNA’lar (miRNAlar), endojen ifade edilen, tek-zincirli ve protein kodlamayan kısa (21-23 nükleotid uzunluğunda) RNA dizileridir. Transkripsiyon sonrası (post-transcriptional) seviyede, gen translasyonunu baskılayarak veya mRNA degradasyonunu (bozunmasını) indükleyerek gen ifadesini düzenlerler. miRNA’lar bitki ve hayvanların her ikisinde de oldukça iyi korunmuş dizilerdir ve miRNA’ların evrimsel olarak gen düzenlenmesinin çok eski bir parçası olduğu ve oldukça hayati bir öneme sahip olduğu düşünülmektedir. Bu çalışmanın amacı zeytin bitkisinde bazı korunmuş mikro RNA’ların tanımlanmasıdır. Daha önce EST kütüphanesi kurulmuş olan G-20 zeytin hattından (Olea europea) belirli korunmuş miRNA’ların analizi gerçekleştirildi. miRNA’ların ayrışmasını sağlamak üzere RNA izolasyon kiti (miRCURY™ RNA Isolation Kit– Cell & Plant) kullanıldı. Ayrıştırılan toplam RNA miktarı Nanodrop® ND-100 spektrofotometre (Nanodrop Technologies, USA) cihazında ölçüldü. Reverse transkripsiyon (RT) ile miRNA’ların cDNA ya sentezi (miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR) gerçekleştirildi. Korunmuş miRNA lara (miR-159, miR-160, miR-171, miR-396, miR-2919 ve miR-8123) özgü 6 primer çifti kullanılarak Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ve Real Time PCR; miRNA QPCR master mix’i kullanılarak AriaMX Real-Time PCR Sistem (Agilent Technologies, Inc.) ile gerçekleştirildi. Olea europaea yaprağından PCR ve Real Time PCR tekniği ile bitkilerde korunmuş olan miR-159, miR-160, miR-171, miR-396, miR-2919 ve miR-8123 miRNA’ları çoğaltıldı. cDNA’lar ilk çoğaltımda miRNA’ya özgü primerler kullanılarak standart PCR ile yapıldı ve yüksek dimerizasyon ile kısa PCR ürünleri verdi. Agaroz jele yüklenen ürünlerin bantları 50 bç uzunluğun altında olduğu için primer dimer mi yoksa PCR ürünü mü olduğu ayırt edilemedi. Real Time PCR reaksiyonunda evrensel primerler kullanılarak, daha uzun PCR ürünleri veren örnekler amplifikasyon grafiği ve erime eğrisi analiziyle başarıyla tespit edildi. Bu çalışmada Real Time PCR ile agaroz jel elektroforezine gerek kalmadan, PCR ile eş zamanlı bir şekilde çıkan ürünlere bakıldı. Böylece korunmuş miRNA'ların zeytinde tespiti daha güvenilir verilerle sağlandı.