Polimerik yüzey aktif maddeler ile plazmid saflaştırılmasının araştırılması

Abstract

Non viral gen tedavileri ve infeksiyöz hastalıklara yönelik DNA aşıları gibi moleküler tedavi yöntemlerinin son yıllarda gelişimi çok miktarda ve yüksek saflıkta plazmid DNA üretimi ihtiyacını arttırmıştır. Plazmid DNA saflaştırılması için standart moleküler biyoloji protokolleri mevcuttur ancak bu protokollerde kullanılan çözeltiler uygun değildir. Tedavi amaçlı ürünlerde kullanılacak protokollerde kullanılan çözeltilerin toksik olmaması ve fazla miktarda üretim için uygun olmaları gerekmektedir.Bu tez çalışmasında plazmid DNA'sının polimerik maddelerin kullanımı ile saflaştırılması amaçlandı. Birinci yöntemde N,N',N'- Polioksietilen (10)-N tallow- 1,3-di amin propan(Peg-10 tallow) katyonik yüzey aktif madde kullanılarak plazmid DNA'nın çöktürülerek saflaştırıldı. Peg-10 tallow bileşiğinin yapısal analizi, elementel analizi, FT-IR, UV-VIS,NMR (1H, 13C) alınarak yapıldı. pDNA'nın peg-10 tallow yüzey aktif maddesi ile çöktürmeişleminin çalışma koşullarının iletkenlik değerleri belirlendi. Geliştirilen Alkali liziz metoduile plazmid DNA ve RNA'dan oluşan lizat örneği elde edildi. Bu aşamada Peg-10 tallow yüzey aktif maddesi ile plazmid DNA'nın lizat örneğinden çöktürülerek saflaştırılması farklı asid (HCl), farklı tuz (NaCl) ve farklı lizat konsantrasyonlarının etkisi incelendi. DNAsaflığı %1'lik agaroz jel elektroforeziyle kontrol edildi.İkinci yöntem olarak biyomoleküllerin ve partiküllerin ayrılmasında kullanılan "AqueousTwo Phase" (ATPS) iki fazlı ayırma sistemi kullanıldı. PEG 600 ile Amonyum Sülfattuzunun sulu ortamda karışımından oluşan ATPS sisteminin bileşimi %35 PEG 600 ve %6(NH4)2SO4'dir. Geliştirilen alkali liziz işlemi ile plazmid DNA ve RNA'dan oluşan lizatörneği elde edildi. %35 PEG 600 ve %6 (NH4)2SO4 bileşimli ATPS sisteme %100(v/v)oranında lizat örneği uygulandı. Ayırma işleminin daha iyi olması için lizat örneği ATPS sisteme uygulandıktan sonra isopropanol çöktürülmesi işlemi ile integre edildi. p(DNA)saflığı %1'lik agaroz jel elektroforeziyle kontrol edildi.Sonuç olarak PEG 600 ile yapılan saflaştırmanın daha başarılı olduğu saptandı.