İnsan adipoz dokusu ve adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmak üzere kriyoprezervasyonunun optimizasyonu - Fındıklı, Necati (My University, 2014)
Amerikan Plastik Cerrahi Derneği verilerine göre, Amerika Birleşik Devletleri'nde (ABD) 2012 yılı içerisinde yaklaşık 300.000 civarında yumuşak doku defekti tamiri amacı ile mastektomi sonrası meme, el ve yüz gençleştirme işlemlerini de kapsayan cerrahi işlem gerçekleştirilmiştir. Bu rakamın her yıl giderek arttığı bilinmektedir. Ülkemizde ise bu alanda çalışmalar yapılsa da rakamsal bir bilgi bulunmamaktadır. Son yıllarda yumuşak doku mühendisliği ve klinik doku tamiri uygulamalarında kök/progenitör hücrelerin kullanılması ve bu yolla elde edilmiş yapay dokuların oluşturulması gibi yeni yaklaşımlar ve çalışmalar, yer almaktadır. Bu bağlamda lipoaspirasyon metodu ile elde edilebilen otolog adipoz doku, içerdiği zengin kök/progenitör hücre popülasyonu sayesinde adı geçen yumuşak doku defektlerinin giderilmesinde ve iyileştirilmesinde yüksek potansiyele sahiptir. Dünya genelinde yılda milyonlarca lipoaspirasyon ve kozmetik amaçlı adipoz doku rezeksiyonu uygulaması yapılmaktadır. Bu uygulamalardan elde edilen adipoz dokuların etkin ve verimli olarak yakın gelecekte yumuşak doku travmaları dışında pek çok farklı doku mühendisliği veya rekonstrüktif cerrahi uygulaması için doğal otolog doku kaynağı olabileceği düşünülmektedir. Elde edilen adipoz dokunun veya içerdiği progenitör hücrelerin daha sonra kullanılmak üzere kriyoprezervasiyonunun yapılması, kriyopbankta uzun sure saklanması ve gerektiğinde biyolojik özelliklerini kaybetmeden kriyobanktan çıkarılarak çözülmesi, ve alıcının ihtiyaç duyulan bölgesine nakli sonrasında iyi sonuçların elde edilmesi oldukça önemli olup, yumuşak doku mühendisliği ve plastik/rekonstrüktif cerrahinin esas hedeflerinden biridir. Ancak kriyobiyolojinin bu alanında hücre ve dokuların dondurulma/çözülmeleri sonrası klinik kullanımlarıyla ilgili varolan ciddi problemler (insan adipoz dokusu ve aynı dokudan elde edilen mezenkimal kök hücrelerin, çözme sonrası düşük viabilite, nakledilen bölgede yüksek re-absorbsiyon vb.) halen giderilememiştir. Şimdiye kadar dünyada bu alanda çeşitli çalışmalar yapılsa da halen verimli bir adipoz doku/adipoz doku kaynaklı-mezenkimal kök hücre kriyoprezervasyon yöntemi geliştirilememiştir. Bunun nedenlerinden biri, şimdiye kadar uygun kriyoprotektanların, kriyoprotektan konsantrasyonlarının, karışımlarının, vitrifikasiyon gibi önemli kriyoprezervasiyon yönteminin adipoz doku/adipoz doku kaynaklı-mezenkimal kök hücrelerde yeterince incelenmemiş olmasıdır. Ayrıca mevcut yaklaşımların doku yenileme ve uygulanan bölgede mevcut hasarın tamirindeki etkinliği konusunda bugüne kadar gerçekleştirilen az sayıda klinik-öncesi ve klinik çalışmada, kök hücre ve içinde bulunduğu niş özellikleri dikkate alınmadığından çalışmalar her zaman olumlu sonuçlar vermemektedir. Mevcut bilgilere dayanarak bu tez çalışmasının amacı, yumuşak doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmak üzere insan adipoz dokusu ve aynı dokudan elde edilen mezenkimal kök hücrelerin, mevcut konvansiyonel yöntemler ile kriyoprezervasyonundaki yapısal ve fonksiyonel düzeydeki etkinliklerinin belirlenmesi, adipoz doku ve içerdiği kök hücrelerin kriyoprezervasyonu ile ilgili mevcut problemlerin giderilmesinde vitrifikasyon metodu ile kriyoprezervasyon rejimlerinin ve yaklaşımlarının etkinliğinin incelenmesi, elde edilen verilere dayanarak insan adipoz doku/adipoz doku-kaynaklı mezenkimal kök hücre kriyoprezervasyon protokollerinin optimize edilmesi ile klinik kullanıma uygun doku ve hücre saklama amaçlı kriyobank oluşturulmasıdır. Belirlenen amaç doğrultusunda çalışma genelinde 10 farklı donörden lipoaspirasyon (n=8) ve cerrahi eksizyon (n=2) uygulamaları sonrası elde edilen adipoz doku örnekleri kullanıldı. Örneklerin 6'sına adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücre izolasyonu amacı ile enzimatik ayrıştırma tekniği uygulandı. Hücre izolasyonu aşamasında ayrıca manyetik tabanlı hücre ayrıştırılması tekniği de kullanıldı. İzole edilen hücrelerin kök hücre olma özellikleri in vitro kültürdeki morfolojik analiz, akış sitometrisi (CD90, CD105, CD29, CD34, CD45) ve in vitro ekspansiyon/farklılaşma testleri kullanılarak ölçüldü. Doku ve hücre kriyoprezervasyonu için, içerisinde kriyoprotektan olarak DMSO, etilen glikol ve sükroz'un farklı konsantrasyonları veya kokteylleri bulunan aşamalı yavaş dondurma (%10 DMSO, %10DMSO+0,2M sükroz, 0,5M sükroz) ve vitrifikasyon teknikleri (%15 DMSO+%15 etilen glikol+0,5M sükroz, %30DMSO+%30 etilen glikol+0,5M sükroz) kullanıldı. Kriyoprezervasyon sonrası dokuların yapısal durumları immünohistokimya tekniği ile, hücrelerin yapısal ve fonksiyonel durumları ise Tripan mavisi boya dışlama testi, TUNEL testi ile DNA fragmantasyon analizi ve in vitro farklılaşma analizi kullanılarak ölçüldü. Çözme sonrası doğrudan dondurulan veya dondurulmuş dokudan izole edilen hücreler ayrıca morfolojik ve in vitro ekspansiyon özellikleri bakımından incelendi. İncelemeler ve ölçümler sırasında elde edilen kantitatif veriler SPSS versiyon 10.0 for windows programı ile değerlendirildi ve değerlendirme sırasında p<0,05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Deney üç aşamada gerçekleştirildi. İlk aşamada elde edilen örneklerden 6'sında (4 örnek lipoaspirasyon ve 2 örnek cerrahi eksizyon yöntemi) enzimatik ayrıştırma metodu uygulanarak hücre izolasyonu gerçekleştirildi. Elde edilen bu hücrelerin in vitro kültürdeki gelişim ve morfolojik özellikleri, akış sitometrisinde elde edilen kök hücre işaretçikleri sonuçları ve in vitro farklılaşma sonrası mezoderm kaynaklı farklı hücrelere dönüşüm özellikleri gösterildi ve mezenkimal kök hücre oldukları konfirme edildi. İkinci aşamada bu hücreler kullanılarak mevcut konvansiyonel kriyoprezervasyon ve vitrifikasyon protokollerinde kullanılan DMSO ve etilen glikol (EG) kriyoprotektanlarının farklı konsantrasyonları (%1 - %30), farklı kombinasyonları ve hücre ile farklı inkübasyon süreleri (10 – 40 dakika) bakımından sitotoksik ve genotoksik etkileri incelendi. DMSO ve etilen glikolün %10'dan yüksek konsantrasyonlarında ve 20 dakika'dan uzun inkübasyon sürelerinde hücresel canlılık düzeylerinde anlamlı azalma gözlendi (p<0,05). Hücre viabilite incelemesi ile eş zamanlı gerçekleştirilen DNA fragmantasyon testlerinde ise adı geçen parametreler yönünden istatistiksel olarak anlamlı bir artış görülmedi (p>0,05). Çalışmanın üçüncü aşamasında, deney kapsamında elde edilen insan adipoz dokuları (n=4) ve adipoz doku-kaynaklı mezenkimal kök hücreleri (n=4), mevcut konvansiyonel ve vitrifikasyon protokolleri kullanılarak doku ve hücre dondurma programlarına alındı. Her iki grup, ayrı ayrı olarak iki farklı metod (aşamalı yavaş dondurma ve vitrifikasyon), farklı inkübasyon süreleri ve kriyoprezervasyon sonrası farklı saklama sıcaklıkları yönünden test edildi. Hücre düzeyinde gerçekleştirilen kriyoprezervasyon uygulamalarında, aşamalı yavaş dondurma gerçekleştirilen %10 DMSO ve %10DMSO+0,2M sükroz grubu ile, vitrifikasyon uygulanan VS1 ve VS2 gruplarında kontrol grubuna göre anlamlı olarak yüksek canlılık oranları elde edildi (sırasıyla %80,2, %88,9, %85,4, %68,2 ve %12,2, p<0,01). Doku düzeyinde gerçekleştirilen kriyoprezervasyon uygulamalarında ise vitrifikasyon uygulanan VS1 ve VS2 grubunda, aşamalı yavaş dondurma uygulanan %10 DMSO ve %10 DMSO+0,2M sükroz gruplarındaki dokulara ve kontrol grubuna kıyasla daha yüksek canlılık oranları elde edildi (sırasıyla %90,2, %82,0, %50,0, %62,8 ve %10,2, p<0,01). Aşamalı yavaş dondurma grubunda dondurulan doku örneklerinin ve içerdikleri kök hücrelerin +4°C 'de ve -20°C'de uzun süreli saklanmaları sonrası canlılık ve fonksiyonelliklerini kaybettikleri gözlendi. Gerek hücre, gerekse doku düzeyinde gerçekleştirilen dondurma ve çözme işlemleri sonrası canlı olarak tespit edilerek kültüre edilen hücrelerin, yapılan in vitro ekspansiyon ve in vitro farklılaşma testlerinde, hücre gelişim hızlarında ve adipojenik, kondrojenik ve osteojenik farklılaşma potansiyelleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık gözlenmedi. Sonuç olarak bu tez çalışması kapsamında, günümüzde kullanılmakta olan farklı konvansiyonel doku ve hücre kriyoprezervasyon protokollerinin ve mevcut literatürde ilk kez olarak farklı vitrfikasyon protokollerinin adipoz doku ve içerdiği mezenkimal kök hücreler üzerindeki etkinlikleri eş zamanlı olarak incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar, aşamalı yavaş dondurma ve vitrifikasyon yöntemi kapsamında kullanılan kriyoprotektanların ve uzatılmış inkübasyon sürelerinin insan adipoz dokusu ve içerdiği mezenkimal kök hücrelerinin viabilitesi ve fonksiyonelliği üzerinde ciddi ve olumsuz etkiler oluşturabildiğini göstermiştir. Sonuçlar ayrıca kriyoprezervasyon işlemlerinin klinik etkinliğinin arttırılması amacı ile doku ve hücre dondurma işlemlerinin ayrı ayrı optimize edilmesi ve uygulanması gerektiğini de doğrulamıştır. Bu bulgulara ilave olarak, mevcut güncel çalışmalarda raporlanmış konvansiyonel saklama sıcaklıklarının (+4°, - 20°C ) adipoz doku ve içerdikleri ADK-MKH popülasyonunun uzun vadeli etkin ve verimli saklanması için yeterli olmadığı görülmüştür. Sonuç olarak tez kapsamında bir adipoz doku/adipoz doku kaynaklı-mezenkimal kök hücre kriyoprezervasyonunda en uygun dondurma rejiminin doku için vitrifikasyon, ADK-MKH'ler için ise aşamalı yavaş dondurma olduğu saptanmıştır. Bu bilgiye dayanarak adipoz doku/adipoz doku kaynaklı-mezenkimal kök hücrelerin kriyoprezervasiyon protokolları geliştirilmiş ve optimize edilmiştir. Çalışmamız sırasında elde edilen sonuçlar doğrultusunda ayrıca etkin bir doku ve hücre kriyobankı oluşturulmuştur. Sonuçlarımızın, yakın gelecekte kök hücre ve doku mühendisliği alanında gerçekleştirilecek yeni araştırma, klinik öncesi veya klinik kullanım amaçlı üretim teknikleri, hücre karakterizasyonu ve farklılaştırma çalışmalarında kullanılmak üzere önemli bir kaynak oluşturacağı düşünülmektedir.
Tez (Doktora) - Yıldız Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2014
Keywords: Adipoz doku; ADK-MKH; Yumuşak doku mühendisliği; Kriyoprezervasyon; Aşamalı yavaş dondurma; Vitrifikasyon