Investigation of novel, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate dependent formate dehydrogenase enzymes - Alpdağtaş, Saadet (My University, 2018)
NADPH bağımlı oksidoredüktazlar, kiral bileşiklerin endüstriyel üretimi için değerli biyokatalizörlerdir. İhtiyaç duydukları yüksek maliyetli kofaktörlerin, yerinde rejenerasyonu için Format dehidrojenaz enzimleri (FDH) oldukça değerli bir seçenektir. NADP+ bağımlılığı ve çok yönlü kararlılık gibi özelliklere sahip olabilecek FDH enzimlerinin tespit edilmesi, koenzim rejenerasyonu açısından bir gerekliliktir. Bu çalışmada iki ayrı NADP+ bağımlı FDH enziminin rekombinant DNA teknikleri ve protein mühendisliği metodları kullanılarak doğal kaynaklardan, biri patojenik bakteri olan Burkholderia dolosa PC543 (BdFDH) ve diğeri etanole toleransı olan bir bakteri olan Lactobacillus buchneri NRRL B-30929 (LbFDH), elde edilmesi ve ayrıca amino / karboksil uçlarına ekli histidin uzantısının BdFDH enzimi üzerine olan etkisinin incelenmesi amaçlanmıştır. Bu mikroorganizmalardan iki yeni NADP+ bağımlı FDH enzimi klonlanmış, saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. İlk FDH, B. dolosa PC543 bakterisinden elde edilmiş, çift koenzim spesifitesi olan ve asidik pH değerlerinde çalışabilen, DMSO toleransına sahip yeni bir enzimdir. Amino / karboksil ucunda histidin uzantısı olan BdFDH' ler, ayrı ayrı ifade edilmiş ve karboksil ucunda histidin etiketi olan enzimin çözünür halde ve aktif iken amino ucunda histidin uzantısı olan FDH enziminin inklüzyon cisimciği şeklinde olduğu ve aktivitesinin olmadığı tespit edilmiştir. Diğer putatif NADP+ bağımlı format dehidrojenaz geni L. buchneri NRRL B-30929 bakterisinin genomik DNA’ sından klonlanmış ve elde edilen LbFDH enzimin asidik koşullarda (pH 4.8-6.2) oldukça aktif olduğu ve yüksek sıcaklık değerlerinde optimum aktiviteye sahip olduğu belirlenmiştir. Enzimin, eşdeğerleri arasında sıradışı bir Tm değerine (78 ◦C) sahip olduğu diferansiyel taramalı kalorimetri ile belirlenmiştir. Dahası, LbFDH' ın 60 ◦C'de ve NADP+ varlığında elde edilen spesifik aktivitesi (24.6 U/mg) tüm NADP+ bağımlı FDH'ler arasında sıradışı bir özelliktir. Enzimler kinetik sabitleri yönüyle değerlendirildiğinde BdFDH enziminin özellikle format iyonu ile LbFDH enziminin ise kofaktör ile etkileşimi oldukça dikkat çekicidir ve protein mühendisliği çalışmaları için model olarak kullanılabileceği düşünülmektedir. Sonuç olarak, DMSO toleransı, asidik koşullara olan dayanıklılık ve koenzim tercihi nedeniyle bu iki yeni enzim, kiral ara bileşiklerin biyokatalizinde kofaktör geri dönüşümünde kullanım için büyük bir potansiyele sahiptir.

NADPH dependent oxidoreductases are remarkable biocatalysts for industrial production of chiral chemicals. For in situ regeneration of required expensive cofactors, Formate dehydrogenases (FDHs) are quite important. It is a significant necessity to determine the FDHs which have NADP+ dependency and also multi-directional stability for cofactor recycling process. In this study, it was aimed to get two, new NADP+ dependent FDHs via recombinant DNA technologies and protein engineering methods from natural sources, a pathogenic bacterium Burkholderia dolosa PC543 (BdFDH) and ethanol tolerant bacterium Lactobacillus buchneri NRRL B-30929 (LbFDH), and also investigate the effect of N- and C- terminus His tag extensions on solubility and activity of BdFDH. Two novel NADP+ dependent FDHs from these microorganisms were cloned, purified and characterized with their unique features. The first enzyme is a new, DMSO tolerant formate dehydrogenase, which has dual cofactor specificity and tolerance to acidic conditions and obtained from B. dolosa PC543 (BdFDH). The expression of N- and Cterminus His-tagged BdFDHs were performed, separately and it was determined that the C-terminus His-tagged enzyme was active and soluble whereas the N-terminal version of enzyme was not. The other putative NADP+ dependent formate dehydrogenase gene was obtained from L. buchneri NRRL B-30929. It was determined that LbFDH has high activity at an acidic pH range (pH 4.8-6.2) and at high temperatures. Its Tm value has been obtained as 78 ◦C by differential scanning calorimetry (DSC) as an unusual value for equivalent enzymes. The specific activity of LbFDH (24.6 U/mg) with NADP+ is a beneficial feature among all NADP+ dependent FDHs at 60 ◦C. If these enzymes are compared in terms of its kinetic constants, it can be said that BdFDH has a great interaction with formate ion and LbFDH has a beneficial affinity towards NADP+, due to these capabilities, both of FDHs can be utilized as model enzymes for protein engineering studies. In conclusion, these two novel enzymes with their performance in acidic pH values, DMSO tolerance and coenzyme preference, have great potential to recycle cofactors in biocatalysis of chiral intermediates in various industries.
Tez (Doktora) - Yıldız Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, 2018
Keywords: Kofaktör rejenerasyonu; NADP+ bağımlı format dehidrojenaz; Lactobacillus buchneri NRRL B-30929; Burkholderia dolosa PC543; Cofactor regeneration; NADP+ dependent formate dehydrogenase; Lactobacillus buchneri NRRL B-30929; Burkholderia dolosa PC543; Biochemical and kinetic characterization