Leishmania parazitlerinden lipofosfoglikan (lpg) saflaştırılması ve aşı modeli olarak lpg-polimer konjugatının antileishmanial etkinliğinin ın vıtro ve ın vıvo incelenmesi

Abstract

Leishmaniasis, enfekte Flebotomus cinsi sineklerin kan emme sırasında Leishmania protozoan parazitlerini memeli konaklara bulaştırması ile ortaya çıkan bir hastalık grubudur. Leishmaniasis, Dünya Sağlık Örgütü'nün (DSO) belirlediği en önemli tropikal hastalıklar listesindeki 6 hastalıktan biridir. Dünyada 350 milyon kişi leishmaniasise yakalanma riski altındadır. Bu hastalık 98 ülkede endemik olup, enfekte kişilerin sayısı ise 12 milyondur. Leishmaniasis aynı zamanda Türkiye'nin de ciddi halk sağlığı problemlerinden biri olup 20 milyondan fazla kişi bu hastalığın tehdidi altındadır. Ülkemizde hastalığın visseral ve özellikle de kutanöz formları görülmektedir. Sağlık Bakanlığı'nın son yıllardaki bilgilerine göre, Türkiye genelinde her yıl yalnızca KL için yaklaşık 5.000 yeni olgu bildirilmektedir. Leishmaniasisin endemik olduğu komşu ülkelerden son yıllarda ortaya çıkan savaş nedeniyle insanların göç etmesi hastalığın giderek artmasına sebep olabilir. Hastalığın dünyada ve ülkemizde bu kadar yaygın olmasının en önemli sebepleri, hastalık etkenlerinde kullanılan ilaçlara, vektörlerinde ise insektisitlere karşı dirençliliğin gelişmesi, birçok memeli hayvanın hastalık etkenlerinin rezervuarı olması, tanıda yaşanan problemler, küresel iklim değişiklikleri gibi nedenlerdir. Tüm bunların yanı sıra günümüzde leishmaniasise karşı etkin bir aşı bulunmamakta ve hastalığı engelleyici etkin bir aşının geliştirilmesinin zorunlu hale geldiği son yıllarda DSÖ tarafından da özellikle vurgulanmaktadır. 1940'lı yıllardan günümüze kadar hastalığa karşı etkin bir aşı geliştirilmesi için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bu yaklaşımlara uygun olarak aşı çalışmaları birinci, ikinci ve üçüncü nesil aşılar olarak gruplandırılmaktadır. Birinci nesil aşıların temelini öldürülmüş ya da canlılığı azaltılmış parazitler, ikinci nesil aşıların temelini tıp ve teknolojinin gelişmesiyle saflaştırılmış antijen aşıları, rekombinant protein aşıları, üçüncü nesil aşıların temelini ise DNA aşıları ve dendritik hücre aşıları oluşturmaktadır. Bütün bu yaklaşımlara rağmen etkin bir aşı geliştirilmesi halen mümkün olmamıştır. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda özellikle saflaştırılmış doğal antijenlere dayalı aşılara önem verilmektedir. Bu gruptan özellikle Leishmania' nın yüzeyindeki baskın bir molekül olup, parazitin makrofajlarda hayatta kalmasını sağlayan ayrıca Flebotomus'lardaki yaşam döngüsü için de oldukça önemli olan LPG molekülünün aşı adayı olarak ümit verici olduğu belirtilmiştir. LPG ile yapılan önceki çalışmalarda L. mexicana ve L. major'dan elde edilen LPG'nin tek başına veya farklı adjuvanlar ile farelerde kısmi koruma sağladığı gösterilmiştir. Böylece yapılan bu çalışmalar, leishmaniasise karşı aşı geliştirilmesinde LPG'nin önemli bir immünojen molekül olduğunu gösterse de, tek başına veya kullanılmış mevcut adjuvanlarla korumanın yetersiz olduğu ortaya çıkmıştır. Yapılan son yayınlarda Leishmania parazitlerinin glikokonjugatlarının aşı olarak kullanılabileceği ancak daha etkin bir taşıyıcı ve adjuvana gereksinim olduğu ortaya konulmuştur. Son yıllarda polielektrolit polimerlerin, protein, doğal mikrobiyal polisakkaritler ve onların sentetik analogları gibi antijenik yapılar ile karıştırılması sonucunda immün uyarıcı olarak görev yaptığı ve bağışıklık yanıtını birkaç kat güçlendirdiği bilinmektedir. Ayrıca Leishmania parazitlerinin LPG'sinin NH2 grupları ile poliakrilik asitin COOH grupları arasında konjugat oluşturmanın teorik olarak mümkün olması bu moleküllerden elde edilen konjugatın aşı olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Buna göre de, bu çalışmada ilk kez olarak Leishmania parazitlerinden LPG'nin izolasyonu, saflaştırılması ve aşı modeli olarak LPG-PAA konjugatının antileishmanial etkinliğinin in vitro ve in vivo incelenmesi amaçlanmıştır. Hedefe ulaşmak için Leishmania parazitlerinin kültürü elde edilip büyük ölçekli kültür metotları geliştirildi. Daha sonra çoğaltılan kültürden biyomas elde edilip LPG izolasyonunda kullanıldı. Saflaştırılan LPG polimer ile konjugasyonu ve karakterizasyonları gerçekleştirip çeşitli hücre kültürlerinde MTT yöntemi ve flow sitometrik olarak toksisiteleri incelendi. Toksik olmadığı belirlenen farklı aşı formülasyonlarının BALB/c farelere enjeksiyonu yapıldı ve immün yanıtlar, ELISA, IFAT, sitokin ölçülmesi, Mikrokültür yöntemi, peritonel makrofajların in vitro enfektifliğinin ölçülmesi, dalak ve karaciğer ağırlıklarının ölçülmesi, Leishman-Donovan Units (LDU) ile parazit yükünün belirlenmesi yöntemleri ile incelendi. Elde edilen sonuçlar incelenen tüm parametrelere göre en yüksek aşı aracılı immün koruma yanıtının LPG-PAA konjugatı ile sağlandığını göstermiştir. Özellikle Leishman-Donovan ünite göre parazit yükündeki en yüksek düşüş %81,17 ile 35 ?g LPG içeren LPG-PAA konjugat içeren grupta olmuştur. Sadece LPG ile immünize edilen kontrol grubunda ise bu değer %44,93'tür. Diğer gruplarda 10 ?g LPG içeren LPG-PAA konjugatında %53,37, 35 ?g LPG içeren LPG + PAA fiziksel karışımında % 55,2, sadece LPG ile immünize edilen grupta %44,93, LPG + Freund's adjuvanı içeren grupta ise %65,8 olarak saptanmıştır. Böylece bu çalışmada Leishmania parazitlerinden LPG'nin izolasyonu, saflaştırılması ve aşı modeli olarak LPG-PAA konjugatının antileishmanial etkinliğinin in vitro ve in vivo incelenmesi sonucunda, hem fiziksel karışımın hem de konjugatın aşı olarak etkinliğinin yüksek olduğu ortaya çıkmıştır. Elde edilen bu sonuçların leishmaniasise karşı aşı geliştirilmesinde bundan sonraki çalışmalara ışık tutacak yeni bir yaklaşımın öncüsü olacağını düşünmekteyiz.