Multiple miyelomalı hastalardan elde edilen kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin osteojenik farklılaşma kapasitelerinin incelenmesi

Abstract

Multipl miyelom, kemik iliğinde malignant plazma hücrelerinin çoğalımıyla karakterize bir plazma hücre neoplazisidir. Multipl miyelom insanların yaşadığı coğrafya, sosyo-ekonomik şartlar ve etnik kökene göre değişiklik gösteren bir kanser türü olmasının yanında diğer kanser türlerinde olduğu gibi hücrelerin genetik yapılarındaki değişimler sonucunda ortaya çıkmaktadır. Erkeklerde kadınlara oranla daha sık rastlanan bu hastalık Avrupa, Kuzey Amerika ve Avustralya başta olmak üzere tüm dünya genelinde yaygın olarak görülmektedir. Multipl miyelomda, kemik ağrısı ve kırıklarının gözlendiği osteolitik kemik lezyonlarıyla sonuçlanana yıkıcı bir kemik hastalığı da gelişmektedir. Hastalarda oluşan kemik kırıkları ve yoğun kemik ağrıları hastalığın ilerleyen evrelerinde veya tedavi süreci içerisinde hayat kalitelerini oldukça düşürmektedir. Normal fizyolojik koşullarda kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinden osteoblastarın farklılaşmasıyla kemik yapımı ve osteoklastik aktivite aracılığıyla kemik yıkımı denge halindedir. Multipl miyelom hastalarında ise kemik iliği mikroçevresindeki plazma hücrelerinin salgıladığı çeşitli faktörler tarafından indüklenen osteoklastik aktivitenin artması ve osteoblastik aktivitenin azalması, kemik yapım-yıkım dengesini bozmaktadır. Bunun bir sonucu olarak tümör gelişimi esnasında kemik lezyonları artmaktadır. Günümüzde multipl miyelom kemik hastalığının tedavisinde kullanılan bisfosfanatlar osteoklastların aktivitelerini inhibe etmekte ve apoptozunu uyarmaktadır. Bunun yanında, osteoklastogenezi engelleyerek osteoklast öncüllerinin oluşumunu inhibe etmektedir. Ancak kemik iliğindeki mezenkimal kök hücrelerden osteoblastların oluşumu ve kemik yapımının arttırılmasına yönelik tedavi stratejileri henüz yetersizdir. Kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin kendini yenileme ve kemik, kıkırdak, kas ve yağ hücrelerine farklılaşma kabiliyetleri bilinmektedir. En son gerçekleştirilen çalışmalarda, multipl miyelom hastalarından elde edilen kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin in vivo ve in vitro olarak osteojenik farklılaşma bozuklukları olduğu belirlenmiştir. Multipl miyelom hastalarının kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerinin osteoblastlara farklılaşma kabiliyetlerinde ki bu kayıp, kemik deformasyonlarının nedeni olarak açıklanabilmektedir. Ancak günümüze kadar multipl miyelom kemik hastalığında osteoblastogenezdeki bu bozukluklar tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu nedenle, multipl miyelom hastalarında kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerinin in vitro osteojenik farklılaşma yolaklarındaki moleküler mekanizmaların ve gen ifadelerinin ayrıntılı incelenmesi, kemik hastalığının patogenezinin anlaşılmasında ve dolayısıyla hedefe yönelik yeni tedavi yöntemlerinin geliştirilmesinde oldukça önemlidir. Günümüze kadar gerçekleştirilen çalışmalarda multipl miyelom plazma hücrelerinin kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerinin osteojenik farklılaşması üzerindeki olumsuz etkilerini belirlemek amacıyla, ortak kültür sistemleri kullanılarak kemik iliği mikroçevresi in vitro ortamda taklit edilmektedir. Gerçekleştirilen çalışmalar, kemik iliği mikroçevresi olmaksızın multipl miyelom kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin sağlıklılardan fenotipik olarak farklı olduğunu ve osteojenik farklılaşma kapasitelerinin düşük olduğunu göstermektedir. Ancak mikroçevrenin etkisi olmaksızın kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin osteojenik indüksiyon sonrasında osteojenik yolaklarda rol oynayan gen ifadelerinin ayrıntılı olarak incelendiği bir çalışma literatürde henüz bulunmamaktadır. Kemik yapımından sorumlu olan osteoblastların, multipl miyelom kemik hastalığında mikroçevrenin etkisi olmaksızın in vitro koşullardaki davranışlarının belirlenmesi ileride gerçekleşmesi olası kök hücre tedavileri veya rejeneratif tıp yaklaşımları için önemlidir. Aynı zamanda kemik iliği mikroçevresinin önemli bir kısmını oluşturan kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin multipl miyelom hastalarındaki in vitro karakterizasyonları tümör sağkalımı ve yayılımında da önemli bulgular elde edilmesine öncü olacaktır. Bu hedefe yönelik olarak amacımız, multipl miyelom hastalarından elde edilen kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin mikroçevrenin etkisi olmaksızın in vitro osteogenik indüksiyon öncesinde ve sonrasında osteojenik yolaklarda rol oynayan gen ifadelerinin analiz edilmesidir. Bu amaçla sağlıklı donörlerden ve multipl miyelom hastalarından kemik iliği mezenkimal kök hücreleri elde edilmiştir. Mezenkimal kök hücrelerin karakterize edilmesinden sonra hücreler, gen ifadelerinin ve alkalen fosfataz aktivitelerinin incelenmesi amacıyla osteojenik farklılaşmaya indüklenmiştir. Alkalen fosfataz aktivitesi tayini 4., 7., 14. ve 21. günlerde ölçülerek sağlıklı ve multipl miyelom grupları karşılaştırılmıştır. Gen ifade analizlerinde özel olarak osteojenik farklılaşma için üretilmiş gerçek zamanlı PZR plakaları kullanılmıştır. Osteojenik indüksiyonun öncesinde ve otuz gün sonrasında osteojenik farklılaşma yolağında rol oynayan genlerin ifadeleri analiz edilmiştir. Veriler istatistiksel olarak eşli t-test kullanılarak değerlendirilmiştir. Elde edilen bulgulara göre multipl miyelom grubunda tüm günlerde ALP aktivitesinin sağlıklılara göre anlamlı olarak düşük olduğu tespit edilmiştir. Gen ifade analizleri karşılaştırıldığında ise sağlıklılara göre MM'da osteojenik yolaklarda rol oynayan 8 genin anlamlı derecede farklı olduğu belirlenmiştir. Bu genlerden BMP4, CSF1, ICAM1 ve VDR ifadeleri multipl miyeloma grubunda osteojenik indüksiyon sonrasında anlamlı derecede artış gösterirken, COL3A1, ITGB1 ve VEGFA gen ifadeleri anlamlı olarak azalmıştır. Ayrıca TWIST1 gen ifadesi sağlıklı mezenkimal kök hücrelerde osteojenik indüksiyon sonrası anlamlı derecede artış gösterirken, multipl miyelom grubunda değişmemiştir. Sonuç olarak elde edilen bulgular ile multipl miyelom hastalarında kemik iliğindeki tümörojenik mikroçevrenin etkisi olmaksızın, in vitro osteojenik indüksiyonları sonrasında mezenkimal kök hücrelerinin alkalen fosfataz aktivitelerinin sağlıklılara göre düşük oluşu ve osteojenik farklılaşmayla ilişkili gen ifade farklılıklarının multipl miyelomdaki kemik defektleri ile ilişkili olabileceği gösterilmiştir.