İmmunostimulan polimerler ile attenüe edilmiş Leismania parazitlerinin aşı olarak etkinliğinin in vitro ve in vivo incelenmesi

Abstract

Türkiye'nin ve dünyanın önemli halk sağlığı problemlerinden birisi olan leishmaniasis, dünya genelinde 98 ülkede yaygın olarak görülmekte olup, 350 milyon insan bu hastalığın tehdidi altında bulunmaktadır. Dünyada 12 milyon kişinin leishmaniasis ile enfekte olduğu ve her yıl bunlara 2 milyon yeni olgunun (1.5 milyon KL, 500.000 VL) eklendiği tahmin edilmektedir. Türkiye'de ise yaklaşık 20 milyon kişi bu enfeksiyona yakalanma riski altındadır. Hastalığın tedavisinde kullanılan ilaçlar oldukça toksik olup, son yıllarda hastalık etkenlerinde kullanılan ilaçlara, vektörlerinde ise insektisitlere karşı direnç geliştiği, ayrıca küresel iklim değişikliği ile hastalığın giderek yaygınlaştığı bilinmektedir. Bununla birlikte çeşitli çalışmalar yapılmasına rağmen, şimdiye kadar Leishmania'ya karşı etkin bir aşı geliştirilmesi mümkün olmamıştır. Günümüze kadar Leishmaniasis'e karşı aşı geliştirilmesinde farklı yaklaşımlar denenmiştir. Bu yaklaşımlardan biri de zayıflatılmış canlı aşılardır. Ancak şimdiye kadar elde edilen zayıflatılmış aşılar da diğer aşı yaklaşımları gibi yeterli etkinlik gösterememiştir. Bunun esas nedenlerinden birisi, parazitlerin uzun süreli kültür ortamında avirulent hale getirilmesi sırasında parazitlerin önemli immunojen moleküllerinin (LPG ve gp63 gibi) giderek azalması veya bu moleküllere ait genlerden sorumlu bölgelerin susturulmasıdır. Buna göre de, etkinliği yüksek olan zayıflatılmış canlı aşıların elde edilebilmesi için bu dezavantajları barındırmayan yeni yaklaşımların geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Aynı zamanda polielektrolitlerin in vivo koşullarda immun cevabı artırdığı, özellikle xix Poliakrilik asit (PAA) ve Polioksidonyum (POX)'un yüksek adjuvant etkisi olduğu bilinmektedir. Ancak, adjuvant özelliği olan polielektrolitlerin canlı Leishmania parazit molekülleri ile etkileşimi sonucunda in vitro (makrofaj hücre kültüründe) ve in vivo koşularda oluşacak immun yanıt ve enfektiflik konusunda hiçbir çalışma bulunmamaktadır. Buna göre de, bu tez çalışmasının amacı ilk kez olarak immünostümülan özelliği olan pozitif ve negatif yüklü polielektrolitlere (PAA ve POX) maruz kalan VL etkeni L.infantum promastigotlarının in vitro makrofaj kültürlerindeki enfektifliklerinin ve oluşturdukları hücre yanıtlarının, in vivo olarak ise parazite karşı oluşan hümoral ve hücresel immün yanıtın incelenmesi sonucunda leishmaniasise karşı attenüe aşı modelinin oluşturulmasında yeni bir yaklaşımın geliştirilmesi olmuştur. Kullanılan Yöntemler: Hedefe ulaşmak için çalışmalarda Giemsa boyama ile enfektiflik tayini, Griess Reaktifi ile Nitrik Oksit Tayini, MTT ile hücre canlılık belirleme yöntemi ve morfolojik incelemeler için taramalı elektron mikroskobu kullanılmıştır. İn vivo çalışmalarda ise, fare serumundaki total IgG miktarı ve sitokin (IL-2, IL-4, IL-10 ve IFN-') miktarları ELISA yöntemi kullanılarak, karaciğer ve dalaktaki parazit yükü LDU birimi olarak, periton makrofajlardaki % enfektiflik düşüşü ise giemsa boyama ile hesaplanmıştır. Ayrıca fare periferik kanındaki parazit varlığı giemsa boyama ve mikro kültür yöntemi (MKY) ile, gecikmiş tip aşırı duyarlılık ise DTH testi ile belirlenmiştir. Veriler, SPSS version 19.0 for Windows programı ile belirlenmiş ve p < 0,05 değeri istatistiki olarak anlamlı kabul edilmiştir. Sonuçlar: In vitro makrofaj kültürü incelendiğinde, polimere maruz kalmış parazitlerin enfektifliğini kaybetmiş olmasına rağmen, makrofajların NO üretimini indüklediği gösterilmiştir. İn vivo fare modellerinde ise PAA'ya maruz kalmış parazitlerle enfekte olmuş fare gruplarında IgG antikor seviyesinin kontrole göre anlamlı olarak arttığı belirlenmiştir. Kontrole göre parazit yükündeki azalma yüzdeleri ise PAA'ya maruz kalan parazitler ile enfekte olmuş farelerin dalakları için 84,27±2,98, karaciğerleri için 89,75±2,12 olduğu belirlenmiştir. POX'a maruz kalan parazitlerle enfekte olmuş farelerin dalakları için 76,92±1,88 ve karaciğerleri için ise 80,02±3,11 oranında parazit yükünde düşüş olduğu tespit edilmiştir (p < 0,05). Özellikle PAA'ya maruz kalan promastigotların immün sistemi Th1 tip hücre proliferasyonu yönünde uyararak, L.infantum enfeksiyonlarında koruyucu rolü olan IFN'' sitokinlerinin üretimini indüklediği ve kontrole göre 7 kat artış olduğu saptanmıştır (p<0,05). Ayrıca POX ile yapılan deney sonuçları ise POX'un 6000 'g/ml ve üzerindeki dozlarının hücre içi parazitlerin proliferasyonunu inhibe ettiği de gösterilmiştir. Böylece bu çalışmada ilk kez olarak PAA ve POX kullanılarak leishmaniasise karşı attenüe olmuş aşı modelinin geliştirilmesinin mümkün olduğu gösterilmiştir. Elde edilen bu sonuçların ileride leishmaniasise karşı aşı geliştirilmesinde önemli bir rol oynayabileceği ve aynı zamanda immünoterapi açısından yeni tedavi yöntemlerinin geliştirilmesinin temelini oluşturabileceği düşünülmektedir.