DNA'nın arkeozomlarla formülasyonu, in vitro karakterizasyonu ve memeli hücre kültürlerinde taşıyıcı olarak kullanılması

Abstract

Bu çalışmada aşırı halofilik özelliğe sahip Haloarcula hispanica suşundan ekstre edilen polar lipidler kullanılarak hazırlanan lipozomların (arkeozomlar) DNA moleküllerinin memeli hücrelerine verilmesinde taşıyıcı olarak potansiyeli araştırılmıştır. H. hispanica pastel portakal izolatı Birbir ve arkadaşları tarafından Tuzköy tuz gölünden izole edilmiştir (2004). Haloarcula hispanica büyük ölçekli steril Brown besiyerine ekilerek 40°C'de 120 dev./dak. çalkalama hızında yaklaşık 30 gün boyunca üretildi. İnkübasyon sonrasında hücreler +4ºC'de, 10 000 dev./dak. hızda, 10 dakika santrifüj edilerek toplandı ve lipid izolasyonunda kullanıldı. Hücreler kloroform/metanol/dH2O (1:2:0.8, v/v) çözeltisi ile 2 saat ekstre edildi. Elde edilen lipidler, rotary evaporatörde buharlaştırılarak evaporasyon balonu cidarında ince bir film haline getirildi. Lipid tabakası hepes tamponu (pH: 7.4) içerisinde 30 dakika vortekslenerek hidrate edildi. Daha sonra örnekler ortalama 100 kez insülin enjektöründen geçirildi ve +4ºC'de saklandı. Plazmitler pEGFP-N1 (Clontech, ABD) ve pSV-ß-Gal (Promega, ABD), Escherichia coli hücrelerinde çoğaltıldı. E.coli hücreleri Luria Bertani besiyerinde (pH = 7.0) hücre yoğunluğu ortalama 4 x 109 h/ml olacak şekilde üretildi. Hücreler santrifüjle toplandı ve plazmit DNA, Peqlab MidiPrep Plazmit Kit kullanılarak saflaştırıldı. DNA'ların yüklemesinde iki farklı yöntem izlendi: a) Hepeste hidrate edilerek hazırlanan boş arkeozomlar belli oranlarda plazmit DNA ile karıştırılarak oda sıcaklığında 20 dakika bekletildi. DNA-lipozom kompleksi oluşumu agaroz jel elektroforezi ile incelendi, b) Arkeal lipidler evaporasyon ile balon cidarında ince bir film haline getirildikten sonra hidrasyon aşamasında plazmit-DNA ortama katıldı. Plazmit DNA'lar ve arkeozom-DNA kompleks oluşumları agaroz jel elektroforezi ile incelendi. Yukarıda belirtildiği şekilde hazırlanan arkeozomların zeta potansiyelleri ve partikül boyutları Zetasizer Nano ZS cihazında ölçüldü. Arkeozomların zeta potansiyellerinin negatif olması nedeniyle arkeozom-DNA komplekslerinin oluşturulmasında Ca2+ iyonları, polibren, DOTAP ve kitosandan yararlanıldı. Transfeksiyonda HEK 293 (human embryonic kidney) hücre hattı kullanıldı. HEK 293 hücre hattı %10 fetal bovin serum içeren D'MEM besiyerinde 37°C %5 CO2 inkübatöründe kültüre edildi. GFP (green fluorescence protein) ekspresyonu floresan mikroskobu ile incelendi. ß-Galaktosidaz ekspresyonu, hücre lizatlarlarında ß-Galaktosidaz aktivitesinin spektrofotometrik yöntemlerle ölçülmesi ile saptandı. Hazırlanan arkeozom örneklerinin morfolojik özelikleri tarayıcı prob mikroskobunun atomik güç modunda (AFM) ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak incelendi. Sadece arkeal lipidlerden hazırlanan arkeozomlarla gerçekleştirilen çalışmalarda düşük düzeyde transfeksiyon elde edilmiştir. Transfeksiyon etkinliğini artırmak için DOTAP, polibren, kitosan ve Ca2+ iyonlarından yararlanılmıştır. Kalitatif incelemeler sonucunda arkeal lipidlerin DOTAP'ın transfeksiyon etkinliğini artırdığı gözlenmiştir. Ca2+ iyonları ile yapılan çalışmada ise artan konsantrasyonda CaCl2'nin arkeozom ile transfeksiyon etkinliğini belirgin düzeyde artırdığı saptanmıştır.