İnsan olfaktör kök hücrelerin izolasyonu kültürünün yapılması karakterizasyonu ve hasar görmüş fasiyal sinirin (ratlarda) rejenerasyonuna etkisinin incelenmesi

Abstract

Fasiyal paraliz dünyada ve ülkemizde görülen, popülasyonda 30/100.000 insidansı olan, konjenital, nörolojik, metabolik, toksik, neoplastik, enfeksiyöz, travmatik, iatrojenik ve idiopatik nedenlere bağlı olarak ortaya çıkabilen bir hastalıktır. Bu hastalık, insan sağlığını ciddi olarak etkilemenin yanında estetik ve dolayısıyla psikolojik problemlere de neden olur. Şimdiye kadar hastalığın tedavisine yönelik çeşitli yaklaşımlar uygulanmasına rağmen gerek iyileşme hızı gerekse de iyileşme hızına bağlı sekeller, hastalığın tedavisinin önünde önemli engeller oluşturmaktadır. Bu nedenle hasar görmüş sinire bağlı patolojilerin giderilmesinde yeni yaklaşımların geliştirilmesi oldukça önemlidir. Kök hücre alanındaki gelişmeler ve kök hücreye dayalı tedavi yaklaşımlarındaki ilerlemeler sinir doku hasarlarının tedavisinde de yeni ümitlere yol açmaktadır. Periferik sinir hasarlarında yağ, kemik iliği ve hipokampal nöral kök hücre kullanan deneysel çalışmalarda bazı olumlu sonuçlar elde edilse de problemin çözümü henüz mümkün olmamıştır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda kök hücre tedavilerinde başarının sağlanması için hasar görmüş bölgenin sahip olduğu mikroçevre ile uygulanan kök hücre kaynağının uygun olması gerektiği vurgulanmaktadır. Literatürde bu konu ile ilgili çalışmalar az sayıda olsa da giderek önem kazanmaktadır. Ayrıca şimdiye kadar fasiyal sinir hasarlarının rejenerasyonunda bu alanda herhangi bir çalışmaya da rastlanılmamıştır. Buna göre de bu tez çalışmasının amacı; insan olfaktör mukoza biyopsi örneklerinden kök hücrelerin izolasyonu, devamlı kültürünün yapılması, karakterizasyonu ve kriyoprezervasyonunu gerçekleştirilmekle, olfaktör kök hücrelerden yeterli miktarda hücre kitlesi elde edilip ilk kez olarak hasar görmüş fasiyal sinir rejenerasyonunda (ratlarda) niş temellerine dayalı yeni bir yaklaşım geliştirilmesi ayrıca ileride hücresel tedaviler ve doku mühendisliği çalışmalarında kullanılmak üzere olfaktör kök hücre kriyobankının oluşturulması olmuştur. Bu amaçla tez kapsamında İstanbul Eğitim ve Araştırma Hastanesi Kulak Burun Boğaz Baş ve Boyun Cerrahisi Bölümü'nde septoplasti operasyonu öncesi onamları alınan 3 hastadan olfaktör mukoza biyopsi örnekleri alınarak Yıldız Teknik Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü Hücre Kültürü ve Doku Mühendisliği Laboratuvarı'nda getirildi ve olfaktör kök hücrelerin izolasyonu, kültürü, karekterizasyonu ve kriyoprezervasyonu gerçekleştirildi. Devamlı kültürü yapılan hücreler morfolojik olarak incelendi. Elde edilen hücrelerin kök hücre karakterizasyonunu yapmak üzere hücreler adipojenik, osteojenik ve nörojenik farklılaşma kitleri ile indüklendi ve akım sitometri yöntemi ile immünfenotipik karakterizasyonları yapıldı ve elde edilen kök hücrelerin kriyoprezervasyonu gerçekleştirildi. Olfaktör kök hücreler, in vivo çalışmalarda kullanılmak üzere CM-DiI ile işaretlendi ve hücrelerin üst üste 9 kez pasajlanmasıyla çok tabakalı hücre kitlesi elde edildi. Elde edilen çok tabakalı hücre kitlesinin canlılığının belirlenmesi için in vitro kültürü yapıldı. CM-DiI ile işaretli olfaktör kök hücre kitlesi ile deneysel fasiyal paraliz oluşturulan ratlarda kök hücrelerin periferik sinir rejenerasyonuna etkisini belirlemek üzere in vivo çalışmalar iki aşamada gerçekleştirildi. Bezm-i Alem Vakıf Üniversitesi Deney Hayvanları Laboratuvarı'nda 7 adet Wistar Hannover (350–380 gr) dişi rat kullanılarak yapılan ön çalışmalarda fasiyal kesi sonrası 4 farklı yöntem kullanılarak kök hücrelerin kesi bölgesine inokülasyonu sağlandı. Çalışmada 1. ratın hasar bölgesine 10µl PBS içinde CM-DiI ile işaretlenen 500.000 olfaktör kök hücre inoküle edildi, 2. ratın hasar bölgesine 10µl PBS içinde CM-DiI ile işaretlenen 500.000 olfaktör kök hücre inoküle edildi ve inokülasyon bölgesi rattan alınan yaklaşık 1mm³ yağ dokusu ile (fasya) ile sarıldı, 3 ve 4. ratın hasar bölgesine 10µl PBS içinde CM-DiI ile işaretlenen 500.000 olfaktör kök hücre inoküle edildi ve inokülasyon bölgesine fibrin glue uygulaması yapıldı, 5 ve 6. ratların hasar bölgesine CM-DiI ile işaretlenen çok tabakalı hücre kitlesi inoküle edildi, kontrol grubu olarak 7. ratın hasar bölgesine 10µl PBS aktarıldı. Deney öncesi fasiyal paralizin ölçümü, deney sonrası ise iyileşmenin belirlenmesi için tam kat kesi öncesi ve sonrası 2., 4., 6., ve 8., haftalarda bıyık hareketleri Wiskers skorlama olarak değerlendirildi. Sonuçlar Mann Whitney U istatistiği kullanılarak hesaplandı. Ön çalışma sonuçları dikkate alınarak in vivo çalışmaların ikinci basamağında 27 adet rat M, T ve K isimleri verilerek 3 gruba ayrıldı her bir grupta ratların sol fasiyal siniri kesildikten ve sinir uçları neurotube poliglikolik asit konduite anastomoz yapıldı. Konduitin içine M grubu için hazırlanan çok tabakalı hücre pelleti, T grubu için PBS eklendi. Kontrol grubu olan K grubuna herhangi bir madde verilmedi. Ratlarda iyileşme 2., 4., 6., 8., ve 10. haftalarda fizyolojik, bıyık hareketleri ve elektrofizyolojik olarak izlendi. 10 hafta sonunda ratlar sakrifiye edilerek hasar bölgesinden histolojik inceleme için preparatlar hazırlandı. Preparatlar hematoksilen, eozin, S100, Toluidin Blue ile boyandı ve florasan mikrokopta incelendi. Sonuçlar Mann-Whitney U ile ve Annova ile yapılan istatistik ile değerlendirildi. Elde edilen sonuçlara göre olfaktör dokudan elde edilen hücrelerin morfolojik, immünfenotipik ve farklılaşma özellikleri bakımından kök hücre karakterine sahip oldukları ayrıca dondurularak saklanan hücrelerin 24 ay sonunda canlılıklarını %91 oranında korudukları belirlendi. Olfaktör kök hücrelerin CM-DiI boyası ile işaretlediği ayrıca hücrelerin 9 kez üst üste pasajlanmasıyla elde edilen çok tabakalı hücre kitlesinin kültür ortamında canlılığını koruduğu belirlendi. Whiskers skorlamalarına göre yapılan ön çalışma sonuçlarına göre, uygulanan 4 farklı yöntem içinde en fazla iyileşmenin görüldüğü grubun olfaktör kök hücreler ile hazırlanan çok tabakalı hücre kitlesi uygulanan grup olduğu belirlendi. 27 rat ile yapılan in vivo çalışmalarda elde edilen fizyolojik ve elektrofizyolojik sonuçlara göre fasiyal sinir rekonstrüksiyonunda olfaktör kök hücreler kullanılan grupta sinir rejenerasyonun daha hızlı gerçekleştiği (p=0,030) ve bıyık hareketlerindeki düzelmenin amplitüd değerlerindeki artış ilişkili olarak daha fazla ve anlamlı olduğu belirlendi (p=0,001). S100 boyama ile yapılan histolojik değerlendirmede gözlenen sonuçlara bakıldığında da M grubunda hasar bölgesine nakledilen kök hücrelerin Schwann benzeri hücrelere dönüştükleri belirlendi. Elde edilen bu sonuçlar olfaktör kök hücrelerin kullanıldığı grupta belirlenen sinir rejenerasyon hızı ve düzeyini destekler niteliktedir (p<0,05). 2012-07-04 KAP02 numaralı proje ile Yıldız Teknik Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Proje Koordinatörlüğü tarafından desteklen bu çalışma ile TÜBİTAK tarafından yayınlanan 2003-2023 Teknoloji Öngörü Çalışmasında vurgulanan "Türkiye'de yapılması gereken bilimsel çalışmalar için kök hücre teknolojilerinin geliştirilmesi ve özellikle rejeneratif tıp uygulamalarında kullanılabilir hale gelmesi" hedefine de uygun olarak ulaşılabilir tek nöral kök hücre olan olfaktör kök hücrelerin ülkemizde ilk kez olarak izolasyonu, karakterizasyonu ve kriyoprezervasyonu gerçekleştirildi, kriyobankı oluşturuldu, doku mühendisliğinde kullanılmak üzere çok tabakalı hücre kitlesi hazırlandı ve fasiyal sinir hasarlarında kullanılmasıyla sinir rejenerasyonunu hızlandıran etkin bir hücresel tedavi yöntemi önerildi.