Doku mühendisliğinde kullanılmak üzere metalik ve biyojenik nanopartiküllerin somatik ve kök hücreler üzerindeki etkisinin incelenmesi

Abstract

Kök hücreler ve nanoteknoloji son yılların en önemli çalışma alanları arasında yer almaktadır. İntradisipliner faaliyetler gerektiren ve böylece hızla gelişen bu bilim dalları birleşerek kök hücre nanoteknolojisi adı altında yeni bir çalışma alanı doğurmuştur. Bulundukları doku ve organların devamlılığını sağlayan kök hücreler rejeneratif tıp ve doku mühendisliğinde son derece önemli role sahipken, nano boyutta yapılar da çeşitli endüstriyel ve medikal alanlara ek olarak özellikle son yıllarda doku mühendisliğinde de giderek daha çok önem kazanmaktadır. Kök hücre nanoteknolojisinde gelişmeler yaşanırken yapılan çalışmalar da nanopartiküllerin yaygın kullanımı çeşitli tartışmalara neden olmaktadır. Nanopartiküllerin solunum, sindirim, intravenöz ve subkütanöz yollar ve dermal kontakt vasıtası ile insan vücuduna girişi endişelere neden olmaktadır. Bu nedenle normal hücre hatları ve özellikle kök hücrelerin nanopartiküller ile etkileşimin incelenmesi oldukça önemlidir. Diğer taraftan günümüzde büyük oranda kimyasal yöntemler ile sentezlenen nanopartiküllerin güvenli sentez yöntemleri ile elde edilmesi amacı ile biyojenik yöntemler de geliştirilmeye başlanmıştır. Biyojenik yöntemler ile sentezlenen nanopartiküllerin normal hücre hatları ve kök hücreler üzerindeki etkileri belirsizdir. Buna göre de bu çalışmanın amacı ilk kez olarak çeşitli fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip kimyasal ve biyojenik nanopartiküllerin (TiO2, Ag, TiO2@Ag) normal hücre hatları (L929 ve J774) ve insan adipoz dokusundan elde edilmiş mezenkimal kök hücreler (ADMKH) üzerindeki etkisinin kıyaslamalı olarak incelenmesi, incelenen nanopartiküllerin kök hücrelerin farklılaşmasına etkisinin belirlenmesi ve elde edilen sonuçların doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta kullanılmak üzere önerilmesi olmuştur. Bu amaçla tez kapsamında kültür çalışmaları Yıldız Teknik Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü Hücre Kültürü ve Doku Mühendisliği Laboratuvarımızda gerçekleştirilmiştir. Hücre kültür çalışmalarında somatik hücre (L929 ve J774) ve adipoz dokudan elde edilen mezenkimal kök hücreler (ADMKH) kullanılmıştır. Hücreler laboratuvarımızda bulunan kriyobanktan çıkarılmış, kültür ortamına adaptasyonu sağlanmış, devamlı kültürü elde edilmiş ve kriyoprezervasyonu gerçekleştirildi. Deneylerde aynı zamanda metalik ve biyojenik nanopartiküller kullanıldı. Metalik nanopartiküller (TiO2, Ag ve TiO2@Ag) YTÜ Malzeme Mühendisliği Bölümü’nde sentezlenerek temin edilmiştir. İlk kez olarak Teucrium stocsianum Bioss bitkisi ekstraktı ile TiO2, Ag ve TiO2@Ag NP’leri ise laboratuvarımızda bitki bazlı olarak sentezlendi. Her iki gruptaki nanopartiküllerin karakterizasyonları YTÜ Merkez Laboratuvarı ve Biyomühendislik Bölümü’müzün Laboratuvarları’nda gerçekleştirilmiştir. Nanopartiküllerin somatik ve adipoz dokudan elde edilen mezenkimal kök hücreler üzerindeki sitotoksisite çalışmaları hücrelerin mitokondriyal etkinliklerinin belirlenmesi amacı ile MTT (3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolyum bromid) yöntemi ile spektrofotometrik olarak belirlendi. Diğer taraftan metalik ve biyojenik nanopartiküllerin adipoz dokudan elde edilen mezenkimal kök hücrelerin adipojenik ve osteojenik farklılaşmalarına etkileri incelendi. Deneyler en az üç kere tekrar edilmiş ve GraphPad Prism 5 programı ile istatistiksel analizler yapılmıştır. Varyansların homojenitesi ANOVA one-way varyansı ile belirlenmiş, p<0.005 değeri istatistiki olarak anlamlı kabul edilmiştir. Deneyler hem somatik ve hem de mezenkimal kök hücreler üzerinde gerçekleştirildi. Her iki gruptan olan nanopartiküllerin beş farklı konsantrasyonunun bu hücre hatları üzerindeki morfolojik, proliferasyon ve farklılaşmalarına etkileri incelendi. Elde edilen sonuçlara göre, kimyasal TiO2 NP J774 için toksik etki gösterirken L929 ve ADMKH için tüm konsantrasyonlarda non-toksiktir. Kimyasal Ag NP hücreler üzerinde genel olarak non-toksiktir. Kimyasal TiO2@Ag NP L929 ve ADMKH hatları için hücre canlılığı da artış göstermektedir. Yeşil TiO2 NP ise J774, L929 ve ADMKH için kullanılan konsantrasyonlarda non-toksiktir. Yeşil Ag NP L929 hücre hattı proliferasyonunu artırmakta, ADMKH proliferasyonunu ise azaltmaktadır. Yeşil TiO2@Ag NP ise J774 hücre hattı üzerinde farklı konsantrasyonlarda farklı etkiler sergilemektedir. Biyojenik TiO2, Ag ve TiO2@Ag NP’lerinin adipoz doku kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin farklılaşmasına etkileri incelenmiştir. Kimyasal Ag ve kimyasal TiO2 nanopatriküllerinin MKH’lerin adipojenik farklılaşmasını artıran nanopartiküller olduğu ancak MKH’lerin osteojenik farklılaşması üzerinde ise pozitif bir etkilerinin olmadığı tespit edilmiştir. Son yıllarda endüstriyel ve medikal alanlarda kimyasal ve biyojenik yöntemler ile sentezlenen nanopartiküllerin sayısında oldukça büyük bir artış yaşanmaktadır. Bu durum da insan vücudunun çeşitli nanopartiküllere maruz kalmasına neden olmaktadır. İnsanoğlunun nanopartiküllere maruziyeti çeşitli endişelere sebebiyet vermektedir. Böylece elde edilen sonuçlar nanopartiküllerin çeşitli yollar ile vücuda girmesinin ardından somatik ve özellikle doku ve organların devamlılığını sağlayan kök hücreler üzerindeki etkilerinin araştırılmasının son derece önemli olduğunu ortaya koymaktadır. Elde edilen sonuçların ilerde biyomedikal ürünlerin tasarlanmasında ve uygulanmasında pratik açıdan oldukça önemli olduğunu göstermektedir. Buna göre de çalışmamızda elde ettiğimiz veriler doğrultusunda amacımıza uygun olarak özellikle doku mühendisliği çalışmalarında tasarlanacak olan ürünler ile ilgili tasarlanan üründen beklenen özellik, bu özelliği karşılayacak nanopartikül ve hücre hattı seçimi, nanopartikül sentez biçimi ve ayrıca uygulanacak olan nanopartikülün konsantrasyonu ile ilgili olarak elde ettiğimiz verilerin göz önüne alınması önerilmektedir.