Theilerisosis’in tedavisinde kullanılabilecek yeni bir ilaç adayı tespit etmek için kumarın türevlerinin theılera annulata enolozını inhibisyon potansiyelinin araştırılması

Abstract

Tropikal theileriosis, bir apikompleksan parazit olan Theileria annulata’nın neden olduğu kene kaynaklı bir hastalıktır. Türkiye’de tüm bölgelerde bu parazitin görülmesi ile birlikte sığırlarda yüksek hastalık ve ölüm oranına sebep olduğu için ekonomik bir öneme sahiptir. Son zamanlarda T. annulata, yaygın olarak kullanılmakta olan antitheilerial ilaç buparvaquone’a karşı direnç geliştirmektedir ve bu nedenle alternatif ilaç adaylarının belirlenmesi gerekmektedir. Enolazın glikolizde 2-fosfogliserik asidin fosfoenolpirüvata dönüşümünü katalizlemesi, çeşitli hücresel fonksiyonlarla ilişkili olabilmesi ve hücre yüzeyinde bir plazminojen reseptörü şeklinde bulunarak parazitik virülansa aracılık edebilmesi, bu enzimin ilaç bağlanabilen potansiyel bir protein hedefi olduğunu göstermektedir. Bu çalışmada T. annulata enolazının inhibisyonu için enzim inhibitörü adayı olarak kumarin türevleri seçilmiştir. Bu bileşikler bitkilerde doğal olarak bulunur ve çeşitli biyolojik aktivitelere sahiptir. Ayrıca, kumarin türevleri genellikle düşük toksisite ile ilişkilendirilmiş olduğundan potansiyel terapötik ilaç adayları olarak kullanılabilmektedir. Bu çalışmanın amacı, henüz bilinen bir inhibitörü olmayan T. annulata enolazının (TaENO) aktivitesi üzerine kumarin türevlerinin inhibisyon potansiyelinin literatürde ilk defa değerlendirilmesidir. Deneysel çalışmalar kapsamında ilk olarak ekspresyon gerçekleştirilerek protein afinite kromatografisi ile saflaştırılmış ve enzim stabilizasyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Daha sonra kumarin türevlerinin inhibitör tarama analizleri, IC50 değerlerinin belirlenmesi, inhibisyon mekanizmasının tespit edilmesi çalışmaları yapılarak, son aşamada protein homoloji modelleme ve inhibitör varlığında ve yokluğunda moleküler yanaştırma ile yapısal olarak analiz edilmiştir. İnhibisyon çalışmaları öncesinde ilk olarak, saflaştırılan TaENO’nun protein stabilizasyon analizleri yapılmış ve enzim çözeltisine 6 M etilen glikol eklendiğinde +4 ⁰C’de TaENO’nun stabil kaldığı belirlenmiştir. İnhibitör tarama analizleri yüksek saflıktaki (>% 95) TaENO ile 38 adet kumarin türevi kullanılarak yapılmıştır. Beş kumarin türevinin [3-(3,4-dihidroksifenil)-6,7-dihidroksi-2H-kromen-2-on (K5); 4-(3,4-dimetoksifenil)-6,7-dihidroksi-2H-kromen-2-on (K8); 4-(3,4-dihidroksifenil)-7,8-dihidroksi-2H-kromen-2-on (K9); 4-(3,4-dihidroksifenil)-6,7-dihidroksi-2H-kromen-2-on (K21) ve 3-(3,4-dihidroksifenil)-7,8-dihidroksi-2H-kromen-2-on (K23)] bu enzim üzerinde en yüksek (>% 90) inhibitör etkisine sahip olduğu tespit edilmiş ve IC50 değerleri belirlenmiştir. Bu kumarin türevleri içinde en düşük IC50 değeri K21 kumarin türevi için 8,871 μM olarak bulunmuştur. K5, K8, K9 ve K23 için IC50 değerleri sırasıyla 27,910 μM, 10,450 μM, 13,170 μM ve 10,863 μM olarak belirlenmiştir. Belirlenen en düşük (<15 μM) IC50 değerlerine sahip dört kumarin türevinin (K8, K9, K21 ve K23) inhibisyon mekanizmasını tespit etmek için kinetik analizler gerçekleştirilmiş ve bu bileşiklerin TaENO aktivitesini yarışmasız inhibisyon mekanizması ile inhibe ettiği tespit edilmiştir. Ayrıca literatürde tavşan kas enolazı üzerinde çalışmış olan ticari inhibitör ENOblock®’un, TaENO’yu inhibisyon potansiyeli de değerlendirilmiş ve TaENO üzerinde çok düşük bir inhibitor etkisine sahip olduğu belirlenmiştir (100 μM’da % 15,04 inhibisyon). Tüm bu çalışmalarda en yüksek inhibisyon potansiyeline sahip olduğu belirlenen K21 kumarin türevinin TaENO’ya bağlandığı MALDI-TOF kütle spektroskopisi kullanılarak doğrulanmıştır. T. annulata enolazının açık ve kapalı konformasyonları homoloji modelleme metodları kullanılarak modellenmiştir. Bu modeller, korunmuş katalitik halka bölgeleri ve aktif bölge rezidüleri ile enolaz süper ailesi içerisinde benzer katlanma modelleri göstermiştir. TaENO modelinin aktif bölge ve potansiyel ilaç bağlanma bölgeleri protein dizi analizleri ile karşılaştırılarak öngörülmüştür. Substratın (2-Fosfogliserik asit, 2-PG) ve belirlenen dört kumarin türevinin TaENO üzerinde muhtemel bağlanma pozisyonlarının öngörülmesi için moleküler yanaştırma analizleri gerçekleştirilmiştir. Bu sonuçlar birlikte değerlendirildiğinde K8, K9, K21 ve K23 kumarin türevlerinin, TaENO'nun güçlü, substrat analogu olmayan ve yarışmasız inhibitörleri olduğunu ortaya koymaktadır. In silico analizler de en yüksek inhibisyon gösteren K8 ve K21 kumarin türevlerinin inhibisyon mekanizmasına paralel olarak, aktif bölge dışında belirlenen bölgelere iyi bir afinite ile bağlandığı göstermiştir. Bu tez çalışması ile yapıya dayalı ilaç geliştirme yaklaşımı kullanılarak literatürde ilk defa TaENO inhibitörleri tanımlanmış ve bu inhibitörler kullanılarak var olan ilaçlara direnç geliştirmiş olan T. annulata enfeksiyonlarının tedavisine yönelik yeni ilaç adayı geliştirme yönünde ileri in vitro ve in vivo analizlerin önü açılmıştır.