Özet:
Tropikal theileriosis, Theileria annulata parazitinin neden olduğu vektör kaynaklı
vakalar arasında en yaygın görülen hastalıklardan biridir ve küresel ölçekte hayvancılık
üretiminde ciddi ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Theileria annulata, Hyalomma
cinsi kene vektörleri tarafından aktarılan ve özellikle Bos taurus ve Bos indicus olmak
üzere ruminant hayvanlarda hastalığa neden olan bir zorunlu hücre içi protozoon
parazitidir. Son yıllarda tropikal theileriosis tedavisinde başarı oranları düşüktür ve
buparvaquona'a karşı direnç rapor edilmiştir. Son yıllarda gerçekleştirilen çalışmalarda
Theileria annulata’nın Buparvaquona’a karşı direnç gösterdiğini ortaya koymaktadır. Bu
sebeple Tropikal theileriosis ile mücadele alanında yeni tedavi yöntemi ve ilaç
çalışmalarının artırılması gerekmektedir. Bu kapsamda 2017 yılında grubumuzda
gerçekleştirilen bir tez çalışmasında bu hastalığa sebep olan Theileria annulata
enolazına karşı yapıya dayalı ilaç tasarım çalışmaları gerçekleştirilmiştir ve Theileria
annulata’nın temel enerji metabolizmasındaki glikoliz yolağında önemli bir enzim olan
enolaz hedef alınarak bu enzimi inhibe eden kumarin türevleri taranmıştır. Bu tez
çalışmasında 38 kumarin türevi arasında yüksek T. annulata enolazın inhibisyon
aktivitesine sahip (IC50<15 μM) kumarin türevleri; K8 (6,7-dihidroksi-4-(3,4-
dimetoksifenil)-kumarin), K9 (7,8-dihidroksi-4-(3,4-dihidroksifenil)-kumarin), K21 (6,7-
dihidroksi-4-(3,4-dihidroksifenil)-kumarin) ve K23 (7,8-dihidroksi-3-(3,4-dihidroksifenil)-
(kumarin) olarak belirlenmiştir. Bir etken maddenin ilaç olarak kullanılabilmesi için söz
konusu bileşiğin parazit hedef molekülünü inhibe etmesi ama konak organizmadaki
eşdeğer molekülü inhibe etmemesi gerekmektedir. Bu amaçla gerçekleştirilen bu tez
çalışmasında parazitin konağı Bos taurus’ta eşdeğer enzim olan enolazın yapıya dayalı
ilaç tasarımı yönünde yapısal, moleküler ve enzimatik analizleri yapılmıştır.
Bu tez çalışmasında Bos taurus enolazını (BtEno3) ifade eden gen klonlanmış, eksprese
edilmiş ve protein % 95 saflıkta afinite kromatografisi ile başarıyla saflaştırılmıştır.
Sıcaklığın ve pH değişimlerinin enzim aktivitesine etkisi analiz edilmiş ve optimum
koşullar 40 °C, pH 6.5 olarak belirlenmiştir. BtEno3’ın biyokimyasal özellikleri
karakterize edilmiştir ve literatürde ilk defa enzimin kinetik parametreleri Vmax ve Km
sırasıyla 0,01305 μmol/dk ve 0.514 mM olarak hesaplanmıştır. Ayrıca, in siliko
analizlerde kullanılmak üzere Bos taurus enolazının 3 boyutlu yapısı homoloji
modellemesi ile oluşturulup kumarinler ve substrat moleküler yanaştırma metodları ile
enolaza yanaştırılmıştır. Enzim-substrat, enzim-kumarin ve enzim-kumarin-substrat
komplekslerindeki etkileşimler 100 ns boyunca moleküler dinamik yöntemler ile simule
edilerek analiz edilmiştir. Enzim-substrat arasındaki etkileşimlerin, mayada deneysel
olarak belirlenen etkileşimler ile aynı olduğu belirlenmiştir. Substratın ve kumarin
türevlerinin enzime tahmini serbest bağlanma enerjileri MM-GB(PB)SA metodları ile
hesaplanmıştır.
T. annulata parazitinin enolazını yüksek etkili olarak inhibe eden K8, K9, K21 ve K23
kumarin türevlerinin Bos taurus enolazının aktivitesine etkisi in vitro olarak çalışılmıştır
ve bu kumarin türevlerinin Bos taurus enolazını T. annulata enolazına kıyasla daha
düşük konsantrasyonlarda inhibe ettiği belirlenmiştir (K8 100 μM konsantrasyonda
%36,87, K9 100 μM konsantrasyonunda %8,13 inhibisyon, K21 IC50: 77,69 μM ve K23
IC50:84,42 μM).
In vitro ve in siliko çalışmalar birlikte değerlendirildiğinde parazit enolazını inhibe eden
K8, K9, K21 ve K23 türevlerinin parazit konağındaki eşdeğer enolazını daha yüksek
kumarin türevi konsantrasyonlarda inhibe ettiği görülmüştür. Bu kumarin türevlerinin
inhibisyon oranları K21>K23>K8>K9 olarak sıralanmıştır. Kumarin türevleri BtEno3’a
bağlandıktan sonraki enzimin aktif bölgesindeki konformasyon değişikleri, enzimsubstrat ve enzim-kumarin etkileşimleri in siliko analiz edilmiştir. Kumarinlerin enzimin
aktif bölgesine bağlanmadığı, bağlandığı oyuklarda sıkı bağlar oluşturmadağı ve aktif
bölgede herhangi bir konformasyon değişikliğine sebep olmadığı belirlenmiştir. Enzimsubstrat etkileşiminde koordinasyon eksikliğine sebep olmadığı in siliko çalışmalar
sonucunda ortaya konmuştur.
Bu tez çalışmasında gerçekleştirilen in vitro ve in siliko çalışmaların sonucunda K8 ve K9
kumarin türevlerinin parazit enolazını konak enolazına kıyasla çok daha etkili olarak
inhibe ettiği belirlenmiştir. Belirlenen bu türevler ile Theilerisosis tedavisine yönelik
yeni ilaç adayı geliştirme yönünde hücre kültürü ve pre-klinik çalışmaların önün
açacaktır.