Leishmania infantum’un farklı antijen kombinasyonlarını içeren poli(laktik-ko-glikolik asit) nanopartiküllerinin sentezi, karakterizasyonu ve visseral leishmaniasis’e karşı aşı adayı olarak etkinliklerinin invitro ve in vivo incelenmesi

Abstract

Leishmaniasis, Leishmania türündeki zorunlu hücre içi parazitlerin neden olduğu tropikal bir hastalık olup Dünya’nın ve Türkiye’nin en önemli halk sağlığı problemlerinden biridir. Dünyada 350 milyon kişi bu hastalığa yakalanma riski altındadır. Hastalık Türkiye’nin de içinde olduğu 98 ülkede endemik olup, enfekte kişilerin sayısı ise 12 milyondur. Özellikle Suriye’de meydana gelen iç savaşlar nedeniyle Güneydoğu Anadolu bölgemizde olgu sayısı oldukça artmış durumdadır. Sağlık bakanlığı verilerine göre 2012-2017 arasında Suriyeli misafirlerde 8.513 Kutanöz Leishmaniasis vakası tespit edilerek tedavileri yapılmıştır. Hastalığın ülkemizde ve dünyada yaygın olmasının başlıca nedenleri; iklim değişiklikleri, hastalığın vektörlerinde kullanılan insektisitlere, parazitlerde ise ilaçlara karşı dirençliliğin gelişmesidir. Tüm bunlar Leishmaniasis’e karşı aşının geliştirilmesinin oldukça önemli olduğunu ortaya koymaktadır. Günümüze kadar üç jenerasyonda aşı adayları geliştirilse de, her birinin farklı dezavantajları nedeniyle henüz etkin ve güvenilir bir aşı elde edilmesi mümkün olmamıştır. Birinci nesil grubuna dahil olan aşılar öldürülmüş parazit antijenleriyle veya zayıflatılmış canlı (attenüe) Leishmania parazitlerinden oluşmaktadır. Attenüe aşılar, parazitin tekrar aktifleşebilme olasılığı olduğundan risk taşımaktadır. Bu nedenle kullanımı sınırlıdır. Çözünür leishmania (ÇLA) ve otoklavlanmış leishmania antijenleri (OLA) gibi antijenler yapısında birçok hedef protein içerdiğinden birçok MHC ile etkileşim olanağı sağlayıp yüksek immün yanıt oluşturabilmektedir. Bunun yanında elde edilmesi kolay ve maliyeti düşüktür. Ancak bu antijenler de tek başlarına ve günümüze kadar çeşitli adjuvanlarla birlikte kullanımı düşük koruma derecesi sergilemiştir. Buna göre de bu antijenlerinin oluşturduğu immün yanıtı arttırabilmek için daha uygun adjuvanların araştırılması oldukça önemlidir. İkinci jenerasyon aşılar daha çok parazitin yüzey molekülleri, hücre içi molekülleri, strese duyarlı molekülleri ve metabolik yolaklardaki diğer birçok biyomoleküller antijen olarak kullanılmıştır. Bunlar içerisinde Lipofosfoglikan (LPG) parazitin yüzeyinde en çok bulunan immünojen bir moleküldür. Ancak tek başına subunit antijenler de yeterli immün yanıt oluşturamamaktadır. Üçüncü nesil içerisinde yer alan DNA aşıları ise nispeten kolay üretilebilmeleri, yönlendirilmesi kolay, immünojen olmaları taşınmasında birçok geni bir araya getirebilme olanağı sağlaması nedeniyle avantajlıdır. Ancak birçoğunun etkinliğinin düşük olması ve yeterli koruma sağlayamaması ve maliyet gibi nedenler dezavantajlarını oluşturmaktadır. Laboratuvarımızda daha önce TÜBİTAK projesi kapsamında tamamlanan çalışmada ilk kez olarak Leishmania parazitlerinin immünojenik yüzey moleküllerinden olan LPG’nin (poliakrilikasit) PAA ile konjugatının in vivo modellerde %80 koruma sağladığı ve böylece önemli bir aşı adayı olduğu ortaya konulmuştur. Ancak son zamanlarda nanoteknolojide meydana gelen gelişmeler aşı çalışmalarına yeni bir boyut getirmiştir. Nanopartiküler, antijenlerin biyolojik sistemde degrede olmadan, kontrollü ve efektif olarak salımını ile hedefe yönelik taşınımlarına olanak sağlamaktadır. Özellikle kombinasyon şeklinde birden fazla antijenin aynı antijen sunucu hücre tarafından alınması nanopartiküler antijen taşıyıcı sitemin en önemli avantajlarından biridir. Taşıyıcı sistem olarak biyouyumlu, biyobozunur ve aynı zamanda adjuvan özelliğe sahip FDA onaylı PLGA (poli laktik-ko glikolik asit) nanopartikülleri sıkça kullanılmaktadır. Literatürü incelediğimizde çözünür ve otoklavlanmış leishmania antijenini ile lipofosfoglikan ikili antijen kombinasyonu içeren PLGA nanopartikülleri ve immünojenik özellikleriyle ilgili herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Buna göre de bu tez çalışmasının amacı, L.infantum parazitlerinden izole edilen lipofosfoglikan molekülünün çözünür leishmania antijeni veya otoklavlanmış leishmania antijeni ile kombinasyon halinde FDA onaylı PLGA nanopartiküllerine enkapsüle edilmesi, karakterizasyonu ve elde edilen nanoformülasyonların etkinliğinin in vitro ve in vivo olarak incelenmesiyle dünyada ve ülkemizde Visseral Leishmaniasis’e karşı yeni nesil aşı adayı formülasyonların geliştirilmesidir. Tezin amaç ve hedefine uygun olarak çalışma kapsamında, tüm parazit antijenini içeren ÇLA ve OLA ile parazit yüzeyinde bol miktarda bulunan immünojen özellikli LPG molekülü elde edilmesi için parazitin biyoreaktörde büyük ölçekli kültürü yapılıp biyomasdan elde edilmiştir. Daha sonra biyomasdan elde edilen antijenler PLGA içerisine enkapsüle edilmiştir. Ardından oluşturulan nanoformülasyonların karakterizasyonu gerçekleştirildi. Elde edilen hem tek başına LPG, ÇLA ve OLA antijenlerini içeren PLGA nanoformülasyonları (F1, F2 ve F3) hem de ÇLA-LPG ve OLA-LPG ikili antijen içeren PLGA nanoformülasyonlarının (F4 ve F5) toksisitesi J774 makrofaj ve L929 fibroblast hücre kültüründe MTT yöntemi ile incelenmiştir. Ardından toksik olmadığı belirlenen formülasyonların makrofaj hücre kültüründe sitokin ve Nitrik Oksit (NO) üretme potansiyeli incelenmiştir. Daha sonra bu nanoformülasyonların aşı adayı olarak koruyucu etkinlikleri in vivo olarak fareler üzerinde incelemek için iki hafta aralıklarla immünizasyon işlemi gerçekleştirilmiş ve oluşan antikor miktarı deney hayvanlarının serum örneklerinden ELISA ile belirlenmiştir. İmmünizasyonların ardından her bir gruptaki fareler L.infantum parazitleri ile enfekte edilmiştir ve enfeksiyonun kontrolü Giemsa boyama ve mikro kültür yöntemi ile takip edilmiştir. Bir ay sonra kontrol grubunda enfeksiyonun tespit edilmesinin ardından fareler sakrifiye edilerek; dalak ve karaciğer parazit yükü (LDU) belirlenmiştir. Ayrıca farelerin dalak lenfositleri izole edilmiş ve lenfositlerden salgılanan IL-4, IL-10, IL-12 ve IFN-γ sitokinleri ticari bir kit yardımıyla tayin edilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre, incelenen farklı konsantrasyonlarda F4 ve F5 nanoformülasyonlarının J774 makrofaj ve L929 fibroblast hücre kültüründe kontrole kıyasla 500 μg/ml’a kadar anlamlı bir toksik etki göstermediği saptanmıştır. Formülasyonların, makrofajların NO üretmeleri üzerindeki etkinliği incelendiğinde ise, makrofaj hücrelerinde NO üretimine en fazla etkiyi kontrole kıyasla NO üretimini 15 kat arttıran F4 nanoformülasyonu ve 20 kat arttıran F5 nanoformülasyonun gösterdiği saptanmıştır. Benzer şekilde aşı formülasyonları uygulanan makrofaj hücrelerinin ürettiği IL-12 ve IFN-γ sitokin seviyelerinin kontrol grubuna göre, 4-6 kat arasında arttırırken tek başına antijen kombinasyonlarıyla anlamlı bir farklılık gözlenmemiştir. Bunun nedeninin, PLGA nanopartiküllerinin içerisindeki antijenlerin zamanla 72 saatlik kısa süre sonunda yalnızca az miktarda antijenin ortama salınması olabilir. IL-4 ve IL-10 seviyelerinde anlamlı bir değişikliğin meydana gelmediği belirlenmiştir. IL-12 ve IFN-γ sitokinlerinin Th1 yanıtını, IL-4 ve IL-10 sitokinlerinin ise Th2 yanıtını indüklediği bilinmektedir. IL-12 ve IFN-γ seviyelerinin kontrole göre yüksek olması immün yanıtın Th1 tipi yönünde gelişebileceğini düşündürmektedir. Daha sonra tüm nanoformülasyonlar Balb/c fareler üzerinde incelendi. En yüksek antikor seviyesi F5 nanoformülasyonu uygulanan gruplarda gözlenmiştir. Ayrıca farelerin sakrifikasyonunun ardından F4 ve F5 formülasyonu ile immünize edilen deney hayvanlarında parazit enfeksiyonuna karşı sırasıyla yaklaşık %75 ve %78 koruma sağlandığı gözlenmiştir. İncelenen bir diğer parametre dalak hücrelerindeki sitokin seviyeleridir. F4 ve F5 nanoformülasyonlarının IL-12 için sırasıyla 9 ve 15, IFN-γ sitokin için ise sırasıyla yaklaşık 10 ve 18 kat arttırdığı, diğer yandan IL-4 seviyelerinde herhangi bir değişikliğin olmadığı ve IL-10 değeri ise F5 formülasyonu için kontrole nazaran 2 kat azalma gösterdi. Elde edilen sonuçlara göre, her iki formülasyonun da farelerde gerek antikor seviyesini gerek parazit yükünde meydana gelen azalma gerekse de Th1 immün yanıtı indükleyen IL-12 ve IFN-γ sitokin seviyelerini arttırması, bu aşı formülasyonlarının immünojenik özelliklerini net bir şekilde ortaya koymaktadır. Bu sonuç uygulanan aşı formülasyonlarının hücresel ve hümoral yanıtı tetikleyerek organlardaki parazit enfeksiyonunu önemli derecede engellediği düşündürmektedir. Böylece bu tez çalışması kapsamında Dünyada ve Ülkemizde ilk kez olarak, Visseral Leishmaniasis’e karşı etkinliği in vitro ve in vivo kanıtlanmış ÇLA-LPG ve OLA-LPG ikili antijen kombinasyonu içeren PLGA temelli yeni nesil nanoaşı formülasyonları geliştirilmiş oldu.