Zeytin (Olea europaea) bitkisinden karbonik anhidraz enzimini kodlayan genin klonlanması

Abstract

Karbonik anhidraz (CA), çinko içeren bir metalloenzimdir. CO2 ve HCO3 - arasında geri dönüşümlü (CO2 + H2O ↔ HCO3 − + H+ ) reaksiyonunu gerçekleştirir ve hayvanlarda, bitkilerde, arke bakterilerde ve öbakterilerde yaygın olarak bulunur. Farklı evrimsel yollarla gelişmiş 5 farklı CA ailesi vardır: α, β, γ, δ ve ζ. CA’lar pH düzenlenmesi, CO2 transferi, iyon değişimi, solunum, biyosentez ve fotosentez gibi birçok farklı biyolojik süreçte yer alır. Ayrıca CA transkriptinin farklı abiyotik streslere yanıt olarak anlatımında artış görülür. Bu çalışmada soğuk stresine maruz bırakılmış zeytin bitkilerinden β-karbonik anhidraz 392 bp uzunluğunda bir cDNA fragmanı klonlandı. Klonlanan cDNA’nın dizini NCBI veritabanında bulunan Oleae europeae kontig dizini ile yüksek oranda benzerlik gösterdi. Kontig dizin bilgisi kullanılarak 3’ ve 5’ uçları için primerler tasarlandı. Tam uzunlukta cDNA klonlamak için önce 3’ RACE reaksiyonları yapıldı ve 1150 bp’lik bir fragman elde edildi. Bu fragman klonlanarak dizin analizi yaptırıldı. BLASTN ve BLASTP analizleriyle tütün ve domates kloroplast CA’ları ile pamuk ve bezelye β-CA’larına %75 üzerinde benzerlik gösterdiği saptandı. İki primer birlikte kullanılarak genomik DNA’dan PCR yapıldı. Yaklaşık 900 bp’lik bir fragman elde edilerek klonlandı ve dizin analizi yaptırıldı. Genomik klonların dizinleri cDNA dizinine %95-96 benzerlik gösterdi

Carbonic anbydrase (CA) is a zinc-containing enzyme that catalyzes the reversible hydration of carbon dioxide (CO2 + H2O ↔ HCO3 - + H+ ) and is widely distributed in animals, plants, archaebacteria, and eubacteria. There are five evolutionarily unrelated CA families: α, β, γ, δ and ζ. CAs are involved in a variety of biological processes including pH regulation, CO2 transfer, ion exchange, respiration, biosynthesis, and photosynthetic CO2 fixation. Expression of CA transcript is differentially up regulated in response to various abiotic stresses. In this study 392bp fragment of β-CA cDNA was cloned from leaves of olive exposed to cold stres. The sequence of cloned fragment shared significant homology with a region of Oleae europeae contig sequence of β-carbonic anhydrase which is found in NCBI databases. Forward and reverse primers were designed using sequence information of the contig. Firstly 3’RACE reactions performed to clone full length cDNA and a fragment about 1150 bp was obtained. The fragment was cloned and sequenced. The sequence showed more than 75% similarity to tobacco and tomato chloroplast CA and cotton and pea β-CAs in BLASTN and BLASTP analysis. Genomic DNA PCR was performed using forward and reverse primers and a fragment of 900 kb was synthesized. The genomic fragment was cloned and sequenced. The sequence of genomic clones showed 95-96% to the sequence of the cDNA clone.