Çinko eksik koşullarda yetiştirilmiş Hordeum spontaneum C. Koch gövdesinden kurulmuş baskılayıcı çıkarım hibridizasyon kütüphanesinden seçilen cDNA'ların moleküler ve biyoinformatik analizleri

Abstract

Çinko bütün organizmalar için önemli bir mikrobesindir ve 1000'den fazla enzim ve proteinin temel bileşenidir. Canlı hücrelerde protein, karbohidrat ve lipid metabolizmasında, replikasyon ve transkripsiyonda, biyomembranların yapısal ve fonksiyonel bütünlüğü için kritik rolleri vardır. Çinko eksikliği tüm canlılarda bir çok bozukluğa neden olur. Düşük çinko koşullarında yetişen bir bitkide cüce gövde, genç yapraklarda kıvrılma ve yuvarlanma, yaprak uçlarının ölümü ve klorozis görülür. Memelilerde ise, çinkonun yetersiz olduğu bir beslenme şekli anemi, savunma sistemi bozuklukları ve gelişimsel problemlere neden olur. Bu nedenle, organizmalarda çinko düzeylerini iyi bir şekilde kontrol eden ve beklenmeyen eksikliklere veya fazlalıklara anında tepki oluşturan hücresel mekanizmalar gelişmiştir. Tüm dünyada yaygın bir sağlık problemi olan çinko eksikliğinin giderilmesi için çinkonun eksik olduğu bilinen tarım alanlarında bu strese dayanıklı ürünler yetiştirilmelidir. Bitki türleri arasında çinko alım etkinliği bakımından genotipik varyasyonlar görülmektedir. Bu varyasyonlar çinkonun alımı, taşınımı ve depolanmasında görev alan proteinleri kodlayan genlerin farklı anlatımından kaynaklanmaktadır. Araştırma grubumuzda çinko eksikliğinde anlatımı olan genlerin yüksek verimlilikle identifikasyonu için Türkiye topraklarına iyi adapte olmuş Hordeum spontaneum C. Koch kullanılmıştır. Önceki projelerimizde, çinko eksik koşullarda yetiştirilmiş Hordeum spontaneum C. Koch yaprak, kök ve gövdesinden elde edilmiş RNA'lar kullanılarak, toplam 5808 klon içeren, üç farklı baskılayıcı çıkarım hibridizasyon (Suppression Subtractive Hybridization=SSH) kütüphanesi kurulmuştur. Yaprağa ait 960 klon ve köke ait 384 klonun dizin ve biyoinformatik analizleri tamamlanmıştır. Bu çalışmada ise gövde SSH kütüphanesinde bulunan cDNA'ların izolasyon ve identifikasyonlarının gerçekleştirilmesi amaçlandı. Bu amaçla, 672 klon rastgele olarak seçilip dizin analizleri gerçekleştirildi. Ham dizin verileri biyoinformatik araçlar kullanılarak işlendi. Öncelikle, düşük kaliteli dizinler, vektör dizinleri ve rekombinant olmayan klonlar, Cygwin yazılımı ile kullanılabilen Phred ve Cross-Match programlarıyla uzaklaştırıldı. Daha sonra, CAP3 ve Phrap programlarıyla kontig ve singletler oluşturulup, her iki program için sonuçlar karşılaştırıldı. Kontig ve singlet dizinlerinin nükleotid ve protein BLAST analizleri gerçekleştirildi. BLAST analizlerinde dizinlerin, metabolizma, savunma ve stres cevabı, yapı ve hücresel organizasyon, transkripsiyon, translasyon, sinyal iletimi ve apoptosisde görev aldığı düşünülen çeşitli genlere benzediği bulundu. Bu genlerden bazılarının yapısal ve fonksiyonel olarak iyi karakterize edilmiş genlerdir. Bunlar içinde Ribuloz-1,5-Bifosfat karboksilaz/oksigenaz (RuBisCO), Lipid Transfer Protein (LTP), BLT4 protein, kitinaz, aktin, patojen-ilişkili protein, UDP-glukoz pirofosforilaz, papain-benzeri sistein proteinaz ve CPN60 proteinlerini kodlayan genler yer almaktadır.