Özet:
Optikçe saf kiral bileşiklerin eldesi hem ürün kalitesi hem de insan sağlığı için
önemlidir. Kimyasal yöntemlerle elde edilen kiral bileşikler sonucunda rasemik
karışımlar elde edilmektedir. Rasemik karışımlar farmasötik, gıda, tarım gibi optik
olarak saf ürün gerektiren sektörlerde problem yaratmaktadır. Kiral moleküllerin
sentezinde kimyasal yöntemler yerine enzimlerin kullanılması optikçe saf ürünlerin
eldesine imkân sağlamaktadır. Endüstriyel üretimde, optikçe saf kiral ürün
eldesinde oksidoredüktaz grubu enzimler kullanılmaktadır. Ancak bu enzimlerin
kullanımı için oldukça pahalı bir koenzim olan NAD(P)H gerekmektedir. NAD+
bağımlı format dehidrogenazlar, formatı CO2‘e okside ederken; NAD+’nin NADH’e
indirger ve NADH varlığında ise, CO2’in indirgenmesini katalizlerler. Bu nedenle
pahalı bir koenzim olan NAD(P)H’ın rejenerasyonu ve CO2’den hidrojen yakıtının
stabilize bir formu olan formik asit üretimi araştırmalarında önemlidir.
Bitkilerde çevresel stres koşulları ile mücadelede anahtar rol oynayan FDH enzimi
ıslah çalışmaları için de önemlidir. Literatürdeki CbFDH, PsFDH, SoyFDH gibi
rekombinant enzimlerinin gerek aktivite gerekse kararlılıkları açısından
geliştirilmesi gerekmektedir. Bu nedenle yeni FDH’lerin araştırılması ve
geliştirilmesi önemlidir. Mikrobiyal kaynaklı FDH’ler hakkında geniş bir literatür
bulunmakla beraber, bitkisel FDH’lerin biyoteknolojik potansiyeli yeteri kadar
değerlendirilmemiştir.
Protein yüzeyindeki metionin amino asitleri oksidatif strese karşı hassastır ve
reaktif oksijen türleri ile metionin sülfokside dönüştürülebilirler. Bu nedenle
proteinin konformasyonunun değişmesinde ve aktivitesinin kaybolmasında kritik
bölgelerdir. Sülfür grubu nedeniyle oksidasyona meyilli metioninin, oksidasyona
dirençli bir lösin amino asidi ile değiştirilmesi oksidatif kararlılığın arttırılmasında
önemli bir stratejidir.
Bu yüksek lisans tezinde yönlendirilmiş mutagenez yöntemi ile GhFDH protein
yüzeyinde M225L, M234L, M243L, M225/243L ve M225/234/243L mutasyonları
yapılarak yüzey metioninlerinin oksidatif kararlılığa olan etkisi araştırılmıştır.
Sonuçlar, M234L (0,72 s − 1 mM − 1) ve M225/234/243L (0,55 s − 1 mM − 1), yabanıl
tipten daha yüksek katalitik etkinliğe sahip olduğunu göstermiştir. Kimyasal
kararlılıkta en dikkat çekici sonuçlar, ikili ve üçlü mutantlarda görülmüştür.
M225/243L ve M225/243L/234L, kef in faktörünü (sırasıyla 12,3x10-5 ve 12,8x10-5
s-1) azaltmıştır.
