Özet:
NAD+-bağımlı format dehidrogenazlar (FDH, EC 1.2.1.2) metilotrofik mikroorganizmalar
ve yüksek bitkilerde yaygın olarak bulunan enzimlerdir. FDH enzimi NAD(P)+ varlığında
formatın CO2’e oksidasyonunu katalizlerken NAD+’ın NADH’a indirgenmesini ve uygun
şartlarda NADH varlığında ise ters yönde, CO2’in indirgenmesini katalizleyebilmektedir.
Dolayısıyla hem CO2 indirgeme reaksiyonlarının geliştirilmesinde hem de kiral
moleküllerin optikçe saf olarak sentezlenmesi sırasında kullanılan NAD(P)H
koenziminin yeniden elde edilmesinde önemli enzimlerdir. Literatür incelendiğinde,
NAD+-bağımlı FDH enzimleri ile ilgili çalışmaların mikroorganizmalar üzerinde
yoğunlaştığı, bitki FDH’leri ile ilgili protein mühendisliği çalışmalarının oldukça az
olduğu görülmektedir. Bu nedenle pamuk (Gossypium hirsutum L.) bitkisinden izole
edilerek E.coli konakçı hücresinde rekombinant olarak üretilebilen Gossypium hirsutum
NAD+-bağımlı FDH (GhFDH) enziminin NAD(P)H rejenerasyonunda kullanılma
potansiyelinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. FDH enzimleri genellikle NAD+ koenzimine
karşı kesin bir spesifite göstermekle birlikte GhFDH’in NADP+’ye karşı da bir afinite
gösterdiği tespit edilmiştir. Belirlenen bu NADP+ afinitesi GhFDH enziminin NAD(P)H
rejenerasyonu için geliştirilmeye değer olduğunu göstermektedir. NADP+ afinitesi
gösteren bir FDH enziminin elde edilmesi endüstriyel olarak en az NADH kadar sıklıkla
kullanılan NAD(P)H koenziminin rejenerasyonu için önemlidir. Bugüne kadar FDH
enziminin koenzim spesifisitesinin değiştirilmesine yönelik çalışmalar sonucunda
NADP+ molekülüne kısmi aktivite gösteren birkaç mutant enzim elde edilmiştir.
Bu çalışmada Bölge Doygunluk Mutasyonu yöntemi kullanılarak GhFDH enziminin
koenzim spesifitesinin genişletilmesi hedeflenmiştir. Elde edilen mutasyonların koenzim
spesifitesinin yanı sıra, substrat spesifitesi, enzim aktivitesi ve termal kararlılığı üzerine
olan etkileri de incelenmiştir. GhFDH’de koenzim spesifitesi açısından önemli bir bölge
olduğu bilinen N184 amino asidine uygulanan Bölge Doygunluk Mutasyonu ile hedef
bölgede mutasyonlar içeren bir akıllı kütüphane elde edilerek mutant GhFDH’ler
karakterize edilmiştir. Kütüphanenin aktiviteye bağlı olarak taranması sonucunda hedef
bölgedeki N184R ve N184H hedef mutasyonlarına ek olarak farklı iki mutant (D123A ve
E198G) daha tespit edilmiştir. Taramalar sonucu seçilen bir başka mutantta ise sadece
nükleotid değişimi gerçekleştiği, amino asidin aynı kaldığı görülmüştür (N184N,
AACAAT).
N184R mutantının katalitik aktivitesi (kcat/Km) koenzim olarak NAD+ kullanıldığında
yabanıl tip GhFDH’e göre 0.39 s-1mM-1’dan 0.0048 s-1mM-1’a düşmüştür. NADP+ koenzimi
kullanılarak yapılan aktivite ölçümlerinde N184R’nin katalitik aktivitesi yabanıl tip
GhFDH’e göre 0.0042 s-1mM-1’dan 0.00049’a düşüş göstermiştir. Yabanıl tip GhFDH’in
termal kararlılığı (T0.5) 53.8oC iken, N184R için 50.37oC olarak hesaplanmıştır. N184H
mutantının katalitik aktivitesi NAD+ kullanıldığında 0.017 s-1mM-1 olarak ölçülürken,
NADP+ kullanıldığında katalitik aktivite 0.00049 s-1mM-1 olarak belirlenmiştir. Termal
kararlılık ise N184H için yabanıl tip GhFDH’e göre yaklaşık 1oC düşüş göstermiştir.
Bununla birlikte hedef dışı rastlanan iki mutasyon noktası olan D123A ve E198G’de
herhangi bir aktivite elde edilmemiştir. İleriki çalışmalarda ikinci tur bölge doygunluk
mutasyonu ve koenzim spesifitesi için önemli olduğu bilinen farklı residulara bölge
doygunluk mutasyonu uygulanarak, NADP+ spesifitesi için önemli bir potansiyele sahip
olan GhFDH enziminin koenzim tanıma aralığının genişletilebileceği düşünülmektedir.