Özet:
NAD+ bağımlı format dehidrogenazlar (FDH, EC 1.2.1.2), kiral moleküllerin
sentezi için kullanılan ve pahalı bir koenzim olan NAD(P)H' nin yenilenmesi için
özellikle farmasötik endüstrisinde önemli enzimlerdir. Bununla birlikte, FDH
enzimleri, stabilite yetersizliği nedeniyle, biyotransformasyon koşulları altında
hızlı bir aktivite kaybı göstermektedir. Enzim stabilitesi, endüstriyel
biyotransformasyon işlemlerinin gelişimi için sınırlayıcı bir faktördür. Biyotik ve
abiyotik stres koşullarında bitki büyümesi üzerindeki etkileriyle ilgili çok sayıda
veri bulunmasına rağmen, bitki kaynaklı rekombinant FDH' lerin stabilitesi
konusundaki bilgimiz sınırlıdır. Bu durum bitki kaynaklı FDH' lerin biyoteknolojik
potansiyelinin değerlendirilmesini de kısıtlamaktadır. Bu nedenle, çalışmamızda
Gossypium hirsutum' dan izole edilen NAD+ bağımlı FDH' nin (GhFDH) stabilitesini
geliştirmek amacıyla bölgeye yönelik mutagenez yöntemi kullanılmıştır. GhFDH
yapısında bulunan 3 metiyonin amino asidi oksidatif strese dayanıklı lösin amino
asidi ile yer değiştirilerek bu değişimlerin enzimin katalitik özelliklerine ve
stabilitesine olan etkisi araştırılmıştır. Metiyonin-lösin değişimi için rekombinant
GhFDH enziminin M258, M294 ve M299 konumları seçilmiştir. Mutant GhFDH
proteinlerin homoloji modellerinin yapılmasının ardından aktivite ve stabilite
deneyleri yapılarak bu mutasyonların protein aktivitesi ve stabilitesi üzerindeki
etkileri değerlendirilmiştir. M294L ve M299L mutant enzimlerinin aktivite
göstermeme nedeninin bu konumlardaki metiyonin amino asitlerinin katalitik
aktivite için önemli olan amino asitler ile kritik etkileşim içinde olduklarını ve bu
nedenle enzimin katalitik aktivitesinin kaybına sebebiyet verdiklerini
düşündürmektedir. M258L mutantının katalitik aktivitesi (kcat / Km) yabanıl
GhFDH’ e kıyasla 0.39 s-1 mM-1‘ dan 0.29 s-1 mM-1’ a düşmüştür. Stabilite deneyleri
sonucu M258L mutasyonunun termal stabilitede 6 0
C’ lik bir düşüşe neden
olduğunu göstermektedir. Oksidatif stabilite deneyleri sonucunda ise 50 mM H2O2’
de yabanıl tip GhFDH’ e göre önemli bir fark göstermese de, 100 mM’ lık H2O2 ’ a
maruz bırakılan M258L mutantının yabanıl GhFDH den 2 kat daha fazla süre
aktivitesini koruduğu tespit edilmiştir. Oksidatif stabilitesinde görülen bu sonuç
M258L mutantının geliştirilmek için umut vaadedici olduğunu ortaya
koymaktadır. Çoklu mutasyonlar ve CD ölçümleri ile yapısal analizler yapılarak
mutasyonların enzimin aktivite ve stabilitesine olan etkisi incelenmelidir.
